ຂ່າວ

ຂໍ​ຂອບ​ໃຈ​ທ່ານ​ສໍາ​ລັບ​ການ​ຢ້ຽມ​ຢາມ Nature.com​.ເວີຊັນຂອງຕົວທ່ອງເວັບທີ່ທ່ານກໍາລັງໃຊ້ມີການສະຫນັບສະຫນູນ CSS ຈໍາກັດ.ເພື່ອປະສົບການທີ່ດີທີ່ສຸດ, ພວກເຮົາແນະນຳໃຫ້ທ່ານໃຊ້ບຣາວເຊີທີ່ອັບເດດແລ້ວ (ຫຼືປິດການນຳໃຊ້ໂໝດຄວາມເຂົ້າກັນໄດ້ໃນ Internet Explorer).ໃນເວລານີ້, ເພື່ອຮັບປະກັນການສະຫນັບສະຫນູນຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ພວກເຮົາຈະສະແດງເວັບໄຊທ໌ໂດຍບໍ່ມີຮູບແບບແລະ JavaScript.
ຈຸລັງມະເຮັງໄດ້ພັດທະນາກົນໄກຕ່າງໆເພື່ອເອົາຊະນະຄວາມກົດດັນຂອງຈຸລັງແລະສືບຕໍ່ກ້າວຫນ້າ.Protein kinase R (PKR) ແລະຕົວກະຕຸ້ນທາດໂປຼຕີນຂອງມັນ (PACT) ແມ່ນຕົວຕອບໂຕ້ເບື້ອງຕົ້ນທີ່ຕິດຕາມສັນຍານຄວາມກົດດັນຕ່າງໆທີ່ນໍາໄປສູ່ການຍັບຍັ້ງການຂະຫຍາຍຈຸລັງແລະ apoptosis.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ລະບຽບການຂອງເສັ້ນທາງ PACT-PKR ໃນຈຸລັງມະເຮັງຍັງບໍ່ຮູ້ຈັກເປັນສ່ວນໃຫຍ່.ໃນທີ່ນີ້, ພວກເຮົາພົບວ່າ RNA ທີ່ບໍ່ແມ່ນລະຫັດຍາວ (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) ແມ່ນມີສ່ວນຮ່ວມໂດຍກົງໃນການຍັບຍັ້ງເສັ້ນທາງ PACT-PKR ແລະສົ່ງເສີມການຂະຫຍາຍຈຸລັງມະເຮັງ.ການນໍາໃຊ້ການກວດສອບຂະຫນາດໃຫຍ່ທີ່ມີປະສິດຕິພາບຂອງ lncRNA ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບມະເຮັງ CRISPRi 971, ພວກເຮົາພົບວ່າ DARS-AS1 ແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງກັບການຂະຫຍາຍຈຸລັງມະເຮັງທີ່ມີການປັບປຸງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ.ດັ່ງນັ້ນ, DARS-AS1 knockout ຍັບຍັ້ງການແຜ່ຂະຫຍາຍຂອງເຊນແລະສົ່ງເສີມການ apoptosis ຂອງເຊນມະເລັງໃນສາຍຈຸລັງມະເຮັງຕ່າງໆໃນ vitro ແລະຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍການຂະຫຍາຍຕົວ tumor ໃນ vivo.ໃນທາງກົນ, DARS-AS1 ຜູກມັດໂດຍກົງກັບໂດເມນການເປີດໃຊ້ PACT ແລະປ້ອງກັນປະຕິສໍາພັນ PACT-PKR, ດັ່ງນັ້ນການຫຼຸດຜ່ອນການກະຕຸ້ນ PKR, eIF2α phosphorylation, ແລະຍັບຍັ້ງການຕາຍຂອງຈຸລັງ apoptotic.ທາງດ້ານຄລີນິກ, DARS-AS1 ສະແດງອອກຢ່າງກວ້າງຂວາງໃນມະເຮັງຫຼາຍຊະນິດ, ແລະການສະແດງອອກຂອງ lncRNA ຫຼາຍເກີນໄປແມ່ນຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງການຄາດຄະເນທີ່ບໍ່ດີ.ການສຶກສານີ້ elucidates ກົດລະບຽບສະເພາະມະເຮັງຂອງເສັ້ນທາງ PACT-PKR ໂດຍ DARS-AS1 lncRNA ແລະສະຫນອງເປົ້າຫມາຍອື່ນສໍາລັບການຄາດຄະເນແລະການປິ່ນປົວມະເຮັງ.
ຄວາມສາມາດໃນການປັບຕົວກັບຄວາມກົດດັນແມ່ນລັກສະນະທີ່ສໍາຄັນຂອງການຢູ່ລອດຂອງເຊນມະເລັງແລະການຂະຫຍາຍພັນ.ການແຜ່ຂະຫຍາຍຢ່າງໄວວາ ແລະຈຸດເດັ່ນຂອງການເຜົາຜານການເຜົາຜານຂອງມະເຮັງສູງສຸດໃນສະພາບແວດລ້ອມຈຸນລະພາກທີ່ຮຸນແຮງ - ການຂາດສານອາຫານ, hypoxia, ແລະ pH ຕໍ່າ - ທີ່ສາມາດເຮັດໃຫ້ເກີດເສັ້ນທາງສັນຍານການຕາຍຂອງເຊນ.dysregulation ຂອງ genes ທີ່ອ່ອນໄຫວຕໍ່ຄວາມກົດດັນເຊັ່ນ: p535, ໂປຣຕີນຊ໊ອກຄວາມຮ້ອນ 6, 7, KRAS8, 9, ແລະ HIF-110, 11, 12, 13 ແມ່ນສັງເກດເຫັນເລື້ອຍໆໃນມະເຮັງ, ດັ່ງນັ້ນການສະກັດ apoptosis ແລະສົ່ງເສີມການຢູ່ລອດ.
Protein kinase R (PKR) ເປັນເຊັນເຊີຄວາມກົດດັນທີ່ສໍາຄັນແລະ subunit kinase ຂອງປັດໄຈການເລີ່ມຕົ້ນ eukaryotic 2α (eIF2α), ການຄວບຄຸມການແປພາສາທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ຄວາມກົດດັນຂອງເຊນກັບການເສຍຊີວິດຂອງເຊນ.PKR ໃນເບື້ອງຕົ້ນໄດ້ຖືກລະບຸວ່າເປັນໂປຣຕີນຕ້ານໄວຣັດໂດຍການກວດພົບຂອງ RNA ສອງສາຍຕ່າງປະເທດ (dsRNA).ເມື່ອເປີດໃຊ້, PKR phosphorylates eIF2αເພື່ອຍັບຍັ້ງການສັງເຄາະທາດໂປຼຕີນຈາກໄວຣັສແລະຈຸລັງ14,15,16.PACT (PKR activator protein) ໄດ້ຖືກລະບຸວ່າເປັນໂປຣຕີນຕົວກະຕຸ້ນ PKR ທຳອິດໃນກໍລະນີທີ່ບໍ່ມີ dsRNA17,18,19,20,21,22,23.ໂດຍຜ່ານການໂຕ້ຕອບໂດຍກົງກັບ PKR, PACT ຖ່າຍທອດຄວາມກົດດັນຕ່າງໆ (ຄວາມອຶດຫິວ serum, peroxide ຫຼືການປິ່ນປົວ arsenite) ໄປສູ່ PKR ແລະເສັ້ນທາງສັນຍານລົງລຸ່ມ.ນອກເໜືອໄປຈາກ eIF2α phosphorylation, ການເປີດໃຊ້ PKR mediated PACT ເຮັດໃຫ້ເກີດເຫດການຕ່າງໆທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການຕອບໂຕ້ຄວາມກົດດັນ, ລວມທັງການປ່ຽນສະຖານະ redox ຜ່ານທາງ PI3K/Akt24, ປັບປຸງການກວດສອບຄວາມເສຍຫາຍ DNA ຜ່ານ p5325,26 ແລະ NF-κB27,28 Regulates transcription, 29. ເນື່ອງຈາກບົດບາດສໍາຄັນຂອງພວກເຂົາໃນການຕອບສະຫນອງຄວາມກົດດັນ, ການແຜ່ຂະຫຍາຍ, apoptosis ແລະຂະບວນການຈຸລັງທີ່ສໍາຄັນອື່ນໆ, PKR ແລະ PACT ແມ່ນເປົ້າຫມາຍການປິ່ນປົວທີ່ມີທ່າແຮງສໍາລັບຫຼາຍໆພະຍາດ, ໂດຍສະເພາະແມ່ນມະເຮັງ30,31,32,33.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ເຖິງວ່າຈະມີຄວາມສໍາຄັນທາງດ້ານການເຄື່ອນໄຫວແລະຊີວະວິທະຍາຂອງ pleiotropic, ລະບຽບການຂອງກິດຈະກໍາ PACT / PKR ໃນຈຸລັງມະເລັງແມ່ນຍັງມີຄວາມຫຍຸ້ງຍາກ.
lncRNAs ແມ່ນຂໍ້ຄວາມທີ່ໃຫຍ່ກວ່າ 200 nucleotides ທີ່ບໍ່ມີທ່າແຮງການຂຽນລະຫັດໂປຣຕີນ.ນັບຕັ້ງແຕ່ໂຄງການຈັດລໍາດັບ genome ທັງຫມົດທີ່ທັນສະໄຫມໄດ້ກໍານົດພັນຂອງ lncRNAs, 35,36 ຄວາມພະຍາຍາມຫຼາຍໄດ້ຖືກດໍາເນີນເພື່ອອະທິບາຍຫນ້າທີ່ທາງຊີວະພາບຂອງພວກເຂົາ.ຮ່າງກາຍທີ່ເຕີບໃຫຍ່ຂອງການຄົ້ນຄວ້າໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ lncRNAs ມີສ່ວນຮ່ວມໃນຫຼາຍຂະບວນການທາງຊີວະພາບ37 ລວມທັງລະບຽບການຂອງ X-chromosome inactivation38,39, imprinting40, transcription41,42, translation43 ແລະແມ້ກະທັ້ງການຂະຫຍາຍຕົວຂອງມະເຮັງ44,45,46,47.ການສຶກສາເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ລາຍງານວ່າ lncRNAs ຈໍານວນຫຼາຍມີສ່ວນຮ່ວມໃນເສັ້ນທາງ PACT/PKR.ຫນຶ່ງໃນການສຶກສາດັ່ງກ່າວໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ lncRNA ASPACT ຍັບຍັ້ງການຖອດຂໍ້ຄວາມ PACT ແລະເພີ່ມການເກັບຮັກສານິວເຄລຍຂອງ PACT mRNA.ການສຶກສາອື່ນໆໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ lncRNA nc886 ຜູກມັດກັບ PKR ແລະ inhibits phosphorylation 49,50 ຂອງມັນ.ມາຮອດປະຈຸບັນ, lncRNA ຄວບຄຸມການເປີດໃຊ້ PKR ທີ່ເປັນສື່ກາງຂອງ PACT ບໍ່ໄດ້ຖືກລາຍງານ.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) ໄດ້ຖືກລະບຸວ່າເປັນ oncogenic lncRNA51,52,53,54.ໂດຍຜ່ານລະບຽບການຂອງ miP-194-5p53, miP-12952 ແລະ miP-532-3p51, DARS-AS1 ໄດ້ຖືກສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງການຂະຫຍາຍຕົວຂອງມະເຮັງຈຸລັງ renal cell ທີ່ຈະແຈ້ງ, carcinoma thyroid ແລະມະເຮັງປອດຂອງຈຸລັງທີ່ບໍ່ແມ່ນຂະຫນາດນ້ອຍ, ຕາມລໍາດັບ.Tong ແລະເພື່ອນຮ່ວມງານຍັງພົບວ່າ DARS-AS1 ສົ່ງເສີມຄວາມຄືບຫນ້າຂອງ myeloma ໂດຍການຮັກສາຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງທາດໂປຼຕີນ 39 (RBM39) RNA-binding motif.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ບໍ່ມີການສຶກສາໃດໆທີ່ໄດ້ດໍາເນີນການກ່ຽວກັບວ່າ lncRNA ນີ້ມີສ່ວນຮ່ວມໃນລະບຽບການຂອງການກະຕຸ້ນ PACT-PKR ແລະການຕອບສະຫນອງຄວາມກົດດັນຂອງຈຸລັງມະເຮັງ.
ທີ່ນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດຫນ້າຈໍການສູນເສຍການທໍາງານຂະຫນາດໃຫຍ່ໂດຍໃຊ້ລະບົບ CRISPRi ແລະກໍານົດວ່າ DARS-AS1 lncRNA ສົ່ງເສີມການຂະຫຍາຍຈຸລັງມະເຮັງຫຼາຍຊະນິດ.ນອກຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ກໍານົດກົນໄກທີ່ສໍາຄັນ: DARS-AS1 ຜູກມັດໂດຍກົງກັບ PACT, ຍັບຍັ້ງການຜູກມັດ PACT ແລະ PKR, ປ້ອງກັນ phosphorylation ຂອງ eIF2α, ຊັ້ນລຸ່ມ PKR, ແລະໃນທີ່ສຸດຍັບຍັ້ງການຕາຍຂອງຈຸລັງ apoptotic.ສະຫຼຸບແລ້ວ, ວຽກງານຂອງພວກເຮົາໄດ້ເປີດເຜີຍ DARS-AS1 lncRNA ເປັນຜູ້ຄວບຄຸມເສັ້ນທາງ PACT-PKR ແລະເປັນເປົ້າຫມາຍທີ່ມີທ່າແຮງສໍາລັບການປິ່ນປົວມະເຮັງແລະການຄາດຄະເນ.
ການສຶກສາການຂະຫຍາຍພັນທຸກໍາຢ່າງກວ້າງຂວາງໄດ້ກໍານົດຫຼາຍຮ້ອຍ lncRNAs ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບມະເຮັງ.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ຫນ້າທີ່ຂອງເຂົາເຈົ້າຍັງບໍ່ຮູ້ຈັກຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ56.ເພື່ອກໍານົດຜູ້ສະຫມັກ lncRNA ທີ່ມີທ່າແຮງທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບຄວາມຄືບຫນ້າຂອງມະເຮັງ, ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດຫນ້າຈໍການສູນເສຍຫນ້າທີ່ສໍາລັບການຫຼຸດຜ່ອນການຈະເລີນເຕີບໂຕຂອງຈຸລັງມະເຮັງລໍາໄສ້ SW620 ໂດຍໃຊ້ລະບົບ CRISPRi (ຮູບ 1a).ຄຸນລັກສະນະທີ່ເປັນເອກະລັກຂອງສາຍຈຸລັງມະເຮັງລໍາໄສ້ SW480 ແລະ SW620 ແມ່ນວ່າພວກມັນມາຈາກເນື້ອງອກປະຖົມແລະມັດທະຍົມໃນຄົນເຈັບຄົນດຽວ.ນີ້ສະຫນອງການປຽບທຽບທີ່ມີຄຸນຄ່າສໍາລັບການສຶກສາການປ່ຽນແປງທາງພັນທຸກໍາໃນການກ້າວຫນ້າຂອງມະເຮັງລໍາໃສ້ທີ່ກ້າວຫນ້າ.ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ວິເຄາະການຖອດຂໍ້ຄວາມຂອງສາຍຈຸລັງມະເຮັງລໍາໃສ້ (SW480 ແລະ SW620) ໂດຍໃຊ້ການຈັດລໍາດັບ RNA ແລະເກັບກໍາຂໍ້ມູນ lncRNA ທີ່ເປັນປະໂຫຍດບາງຢ່າງຈາກວັນນະຄະດີທີ່ພິມເຜີຍແຜ່.ອີງຕາມຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້, ພວກເຮົາໄດ້ອອກແບບຫ້ອງສະຫມຸດ sgRNA ປະສົມປະສານທີ່ມີ 7355 sgRNA oligos ເປົ້າຫມາຍ 971 lncRNAs ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບມະເຮັງແລະ 500 sgRNA oligos ທີ່ບໍ່ມີເປົ້າຫມາຍສໍາລັບການຄວບຄຸມທາງລົບ (ຂໍ້ມູນເສີມ 1).
Schematic ເປັນຕົວແທນຂອງການກວດສອບການນໍາໃຊ້ລະບົບ CRISPRi.b ການເສີມ sgRNA ຫຼັງຈາກການກວດ.ເສັ້ນຈຸດຕາມລວງນອນສະແດງເຖິງ log2 (ການປ່ຽນແປງເທົ່າ) = ±0.58.ເສັ້ນຈຸດຕັ້ງຊີ້ບອກຄ່າ p = 0.05.ຈຸດສີດໍາເປັນຕົວແທນ sgRNA ທີ່ບໍ່ແມ່ນເປົ້າຫມາຍ (ກໍານົດເປັນ NC).ຈຸດສີແດງແມ່ນ sgRNAs ແນໃສ່ DARS-AS1.ຈຸດສີຟ້າແມ່ນ sgRNAs ແນໃສ່ LINC00205, ເປັນ oncogenic lncRNA ທີ່ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນຫນ້ານີ້.fold change = (ການອ່ານປົກກະຕິ, ມື້ 17)/(ການອ່ານປົກກະຕິ, ມື້ 0).c DARS-AS1 sgRNA knockdown inhibited ການຂະຫຍາຍຕົວຂອງເຊນ.ແຖບຂໍ້ຜິດພາດສະແດງເຖິງ ± ການບ່ຽງເບນມາດຕະຖານຂອງສາມການທົດລອງ.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 two-tailed Student's t-test.d ການສະແດງອອກ DARS-AS1 ໃນເນື້ອງອກ (ຊຸດຂໍ້ມູນ TCGA).em ການສະແດງອອກຂອງ DARS-AS1 ໃນຄູ່ຕົວຢ່າງປົກກະຕິແລະເນື້ອງອກຈາກຄົນເຈັບທີ່ມີ BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, ແລະ COAD, ຕາມລໍາດັບ (ຊຸດຂໍ້ມູນ TCGA).p-values ​​ໄດ້​ຮັບ​ໂດຍ​ການ​ນໍາ​ໃຊ້ t-test ຂອງ​ນັກ​ສຶກ​ສາ​ສອງ​ຫາງ​ຄູ່.
ຫຼັງຈາກການກໍ່ສ້າງ plasmid ແລະການຫຸ້ມຫໍ່ lentivirus, ພວກເຮົາໄດ້ຖ່າຍທອດເສັ້ນຈຸລັງມະເຮັງລໍາໄສ້ dCas9-SW620 ກັບຫ້ອງສະຫມຸດຂ້າງເທິງໃນສີ່ການທົດລອງການຕິດເຊື້ອເອກະລາດ.ຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງການຕິດເຊື້ອ (MOI) ສໍາລັບການຕິດເຊື້ອເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນ 0.1-0.3, ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າແຕ່ລະເຊນສາມາດຕິດເຊື້ອໄດ້ພຽງແຕ່ຫນຶ່ງ sgRNA.ຫຼັງຈາກ 18 ມື້ຂອງວັດທະນະທໍາ in vitro, ຂໍ້ມູນການເສີມສ້າງຂອງ sgRNAs ເປົ້າຫມາຍຫຼຸດລົງຫຼືເພີ່ມຂຶ້ນຫຼັງຈາກການກວດສອບ, ໃນຂະນະທີ່ຈໍານວນຂອງ oligonucleotides ການຄວບຄຸມທີ່ບໍ່ແມ່ນເປົ້າຫມາຍແມ່ນຍັງຂ້ອນຂ້າງບໍ່ປ່ຽນແປງເມື່ອທຽບກັບ profile pre-screening, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າເປົ້າຫມາຍຂອງພວກເຮົາມີຫນ້າຈໍສະເພາະສູງ. ຫ້ອງສະໝຸດ.ເຂົ້າ.1b ແລະຕາຕະລາງເສີມ 1). LINC00205, ເຊິ່ງໄດ້ຖືກລາຍງານກ່ອນຫນ້ານີ້ເພື່ອສົ່ງເສີມການເປັນມະເຮັງປອດແລະການຂະຫຍາຍຕົວຂອງມະເຮັງຕັບ58,59,60, ໄດ້ຖືກກວດສອບອອກ (log2 (foldchange) < −0.58, p value < 0.05), ຢືນຢັນຄວາມຫນ້າເຊື່ອຖືຂອງການກວດນີ້ (ຮູບ 1b). LINC00205, ເຊິ່ງໄດ້ຖືກລາຍງານກ່ອນຫນ້ານີ້ເພື່ອສົ່ງເສີມການເປັນມະເຮັງປອດແລະການຂະຫຍາຍຕົວຂອງມະເຮັງຕັບ58,59,60, ໄດ້ຖືກກວດສອບອອກ (log2 (foldchange) < −0.58, p value < 0.05), ຢືນຢັນຄວາມຫນ້າເຊື່ອຖືຂອງການກວດນີ້ (ຮູບ 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, ທີ່ໄດ້ລາຍງານກ່ອນຫນ້ານີ້ເພື່ອສົ່ງເສີມຄວາມຄືບຫນ້າຂອງມະເຮັງປອດແລະມະເຮັງຕັບ58,59,60, ໄດ້ຖືກຍົກເວັ້ນ (log2 (ການປ່ຽນແປງເທົ່າ) <-0.58, p-value <0.05), ຢືນຢັນຄວາມແຂງແຮງຂອງການກວດນີ້ (ຮູບ .1b) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉的（log2（倍数变化）< 前进展58,59,60，被筛选掉的（log2（倍数变化）< 国变化）<姭国国 0.5） LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉的（log2（倍数变化）< 前进展58,59,60，被筛选掉的（log2（倍数变化）< 国变化）<姭国国 0.5） LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, ທີ່ໄດ້ລາຍງານກ່ອນຫນ້ານີ້ເພື່ອສົ່ງເສີມການກ້າວຫນ້າຂອງມະເຮັງປອດແລະຕັບ58,59,60, ໄດ້ຖືກຍົກເວັ້ນ (log2 (ການປ່ຽນແປງເທົ່າ) <-0.58, p-value <0.05), ຢືນຢັນຄວາມແຂງແຮງຂອງການກວດນີ້ (ຮູບ .1b).
ໃນບັນດາ lncRNAs ທັງຫມົດທີ່ໄດ້ຮັບການທົດສອບ, DARS-AS1 ຍັງໄດ້ຮັບການກວດກາ, ດ້ວຍສາມ cognate sgRNA oligonucleotides ຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຫຼັງຈາກ 18 ມື້ຂອງວັດທະນະທໍາ, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າການຫຼຸດລົງຂອງ lncRNA ນີ້ເຮັດໃຫ້ການຂະຫຍາຍມະເຮັງຫຼຸດລົງ (ຮູບ 1b).ຜົນໄດ້ຮັບນີ້ໄດ້ຮັບການສະຫນັບສະຫນູນເພີ່ມເຕີມໂດຍການວິເຄາະ MTS ໃນຈຸລັງມະເຮັງ colorectal ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າອັດຕາການຂະຫຍາຍຕົວຂອງຈຸລັງ knockdown DARS-AS1 ແມ່ນຫຼຸດລົງພຽງແຕ່ເຄິ່ງຫນຶ່ງເມື່ອທຽບກັບຈຸລັງຄວບຄຸມ (ຮູບ 1c) ແລະສອດຄ່ອງກັບບົດລາຍງານທີ່ຜ່ານມາຂອງມະເຮັງຫຼາຍຊະນິດອື່ນໆ.: ມະເຮັງຫມາກໄຂ່ຫຼັງຂອງຈຸລັງທີ່ຊັດເຈນ, ມະເຮັງຕ່ອມ thyroid ແລະມະເຮັງປອດທີ່ບໍ່ແມ່ນຈຸລັງຂະຫນາດນ້ອຍ51,52,53,55.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ຫນ້າທີ່ແລະກົນໄກໂມເລກຸນຂອງມັນຢູ່ໃນມະເຮັງລໍາໄສ້ໃຫຍ່ຍັງບໍ່ໄດ້ຮັບການຂຸດຄົ້ນ.ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາເລືອກ lncRNA ນີ້ສໍາລັບການສຶກສາຕື່ມອີກ.
ເພື່ອສຶກສາການສະແດງອອກຂອງ DARS-AS1 ໃນຄົນເຈັບ, ພວກເຮົາໄດ້ວິເຄາະຕົວຢ່າງເນື້ອງອກ 10,327 ຢ່າງຄົບຖ້ວນຈາກໂຄງການ Cancer Genome Atlas (TCGA).ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ DARS-AS1 ສະແດງອອກຢ່າງກວ້າງຂວາງແລະຖືກຄວບຄຸມຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນຈຸລັງທີ່ມີສຸຂະພາບດີໃນຫຼາຍໆເນື້ອງອກ, ລວມທັງໂຣກມະເຮັງລໍາໄສ້ໃຫຍ່ (COAD), ມະເຮັງຈຸລັງທີ່ຊັດເຈນຂອງຫມາກໄຂ່ຫຼັງ (KIRC), ແລະໂຣກມະເຮັງຈຸລັງ renal papillary cell carcinoma (KIRP)..ໜ້ອຍຫຼາຍ (ຮູບ 1d ແລະ ຕື່ມ Fig. 1a, b). ການວິເຄາະຕົວຢ່າງເນື້ອງອກທີ່ມີສຸຂະພາບດີເປັນຄູ່ໄດ້ຢືນຢັນເຖິງການສະແດງອອກທີ່ສູງຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຂອງ DARS-AS1 ໃນເນື້ອງອກຂອງມະເຮັງພົກຍ່ຽວ urothelial carcinoma (BLCA), ມະເຮັງຕ່ອມລູກໝາກໄຂ່ຫຼັງ (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), ມະເຮັງປອດ squamous cell carcinoma (LUSC) , ມະເຮັງເນື້ອງອກຂອງມົດລູກ (UCEC), ມະເຮັງປອດ adenocarcinoma (LUAD), ມະເຮັງຕັບຕັບ (LIHC), ມະເຮັງຕ່ອມລູກໝາກໄຂ່ຫຼັງ (KIRP), ແລະມະເຮັງລຳໄສ້ໃຫຍ່ (COAD) (p value <0.05) (ຮູບ 1e–m) . ການວິເຄາະຕົວຢ່າງເນື້ອງອກທີ່ມີສຸຂະພາບດີເປັນຄູ່ໄດ້ຢືນຢັນເຖິງການສະແດງອອກທີ່ສູງຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຂອງ DARS-AS1 ໃນເນື້ອງອກຂອງມະເຮັງພົກຍ່ຽວ urothelial carcinoma (BLCA), ມະເຮັງຕ່ອມລູກໝາກໄຂ່ຫຼັງ (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), ມະເຮັງປອດ squamous cell carcinoma (LUSC) , ມະເຮັງເນື້ອງອກຂອງມົດລູກ (UCEC), ມະເຮັງປອດ adenocarcinoma (LUAD), ມະເຮັງຕັບຕັບ (LIHC), ມະເຮັງຕ່ອມລູກໝາກໄຂ່ຫຼັງ (KIRP), ແລະມະເຮັງລຳໄສ້ໃຫຍ່ (COAD) (p value <0.05) (ຮູບ 1e–m) .ການວິເຄາະຕົວຢ່າງທີ່ມີສຸຂະພາບດີ/ເນື້ອງອກທີ່ເປັນຄູ່ຍັງໄດ້ຢືນຢັນການສະແດງອອກທີ່ສູງຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຂອງ DARS-AS1 ໃນພົກຍ່ຽວ urothelial carcinoma (BLCA), ເນື້ອງອກຂອງຈຸລັງທີ່ຈະແຈ້ງ ແລະມະເຮັງຕ່ອມລູກໝາກ (KIRC), ມະເຮັງຕ່ອມລູກໝາກ (PRAD), ເນື້ອງອກຂອງຈຸລັງປອດ squamous cell carcinoma (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– ມ). , endometrial carcinoma of the corpus uteri (UCEC), adenocarcinoma of the lung (LUAD), hepatocellular carcinoma of the liver (LIHC), papillary cell carcinoma of the ຫມາກໄຂ່ຫຼັງ (KIRP), ແລະ adenocarcinoma of the colon (COAD) (p value < 0.05) (ຮູບ 1e– m).配对 / 健康健康肿瘤样本分析了 as dars -1 在了在膀胱皮癌皮癌皮癌皮癌在在前列腺腺癌腺腺癌 (Kirc), 腺腺癌细胞癌前列肺鳞状细胞癌 (lusc) 肿瘤中中中显着更高表达，子宫体子宫 的更多内容<0.05) (图1e-m).配对对对对 / 肿瘤样本肿瘤样本肿瘤样本了了了了了了了了了皮癌皮癌皮癌皮癌皮癌皮癌皮癌皮癌皮癌皮癌皮癌皮癌皮癌皮癌皮癌皮癌皮癌皮癌皮癌细胞癌细胞癌细胞癌细胞癌细胞癌细胞癌细胞癌细胞癌细胞癌细胞癌细胞癌细胞癌细胞癌细胞癌前列前列前列前列腺腺癌腺腺癌细胞癌细胞癌细胞癌细胞癌细胞癌细胞癌细胞癌细胞癌细胞癌(lusc) 肿瘤肿瘤的的的中中中中中中中中中中中中中中中中中中中中中中癌癌癌癌癌肾肾 (Luad) 肝肝肝肝细胞癌肾肾肾肾肾肾乳头状乳头状乳头状癌（kirp）（coad）（p值<0.05）（图1e-m） .ການວິເຄາະຕົວຢ່າງທີ່ມີສຸຂະພາບດີ / tumor ສະຫນັບສະຫນູນບົດບາດຂອງ DARS-AS1 ໃນພົກຍ່ຽວ urothelial carcinoma (BLCA), clear cell renal cell carcinoma (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), ແລະເນື້ອງອກ squamous cell carcinoma (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). ການສະແດງອອກໃນ corpus uterine carcinoma (UCEC), ປອດ adenocarcinoma (LUAD), hepatocellular carcinoma (LIHC), renal papillary cell carcinoma (KIRP), ແລະ colon adenocarcinoma (COAD) (p value <0.05) (ຮູບ 1e -m).ຮ່ວມກັນ, ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ DARS-AS1 ແມ່ນສະແດງອອກຢ່າງກວ້າງຂວາງແລະສູງໃນຫຼາຍໆຊະນິດຂອງມະເຮັງ.
ເນື່ອງຈາກວ່າ DARS-AS1 ແລະ DARS (gene encoding the antisense strand) ແບ່ງປັນຕົວສົ່ງເສີມອັນດຽວກັນ ແລະຕັ້ງຢູ່ຂ້າງກັນ, ພວກເຮົາອອກແບບ shRNA ສະເພາະເພື່ອລົບ DARS-AS1 ແຕ່ບໍ່ແມ່ນ DARS (ເພີ່ມເຕີມ Fig. 2a,b ແລະຕາຕະລາງເສີມ 2) .ນອກເຫນືອຈາກ SW620, ພວກເຮົາຍັງໄດ້ນໍາໃຊ້ສາມສາຍເຊນອື່ນໆທີ່ສະແດງອອກຢ່າງສູງ DARS-AS1 ເພື່ອສຶກສາປະສິດທິພາບແລະຫນ້າທີ່ຂອງ shRNA knockdown (ຕາຕະລາງເສີມ 3).ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າທັງສາມ shRNAs ທີ່ພັດທະນາບັນລຸໄດ້ຢ່າງຫນ້ອຍ 80% ປະສິດທິພາບການລົບ DARS-AS1 ໂດຍມີຜົນກະທົບເລັກນ້ອຍຕໍ່ປະລິມານຂອງ DARS mRNA (ຮູບພາບເສີມ 2c–f).ນອກຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາພົບວ່າ DARS-AS1 knockdown ກັບ shRNAs ເຫຼົ່ານີ້ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ inhibited ການຂະຫຍາຍຕົວຂອງເຊນໃນສາຍຈຸລັງມະເຮັງ colorectal SW620 (49.7%) ແລະ HCT116 (27.7%), ເສັ້ນຈຸລັງມະເຮັງເຕົ້ານົມ MBA-MD-231 (53.4%).) ແລະເສັ້ນຈຸລັງ hepatoma HepG2 (ການຫຼຸດຜ່ອນ 92.7%), ເຊັ່ນດຽວກັນກັບຄວາມສາມາດຂອງພວກມັນໃນການສ້າງເປັນຮູບຊົງທີ່ບໍ່ມີຕົວຊີ້ (ການຫຼຸດຜ່ອນສະເລ່ຍຂອງ ~ 50.8%, 44.6%, 40.7% ແລະ 75.7% ຕໍ່ເສັ້ນຈຸລັງ) (ຮູບ 2a, b).ໃນ SW620, ຜົນໄດ້ຮັບຂອງການວິເຄາະການສ້າງອານານິຄົມໄດ້ຢືນຢັນຕື່ມອີກວ່າ DARS-AS1 shRNA ຂັດຂວາງການຂະຫຍາຍຕົວຂອງເຊນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໂດຍມີການຫຼຸດລົງໂດຍສະເລ່ຍປະມານ 69.6% (ຮູບ 2c).
ຜົນກະທົບຂອງ shRNA ຄວບຄຸມ ແລະ DARS-AS1 shRNA ຕໍ່ການຂະຫຍາຍເຊລ (a) ແລະການສ້າງ spheroid (b) ໃນ SW620, HCT116, MBA-MD-231, ແລະຈຸລັງ HepG2.c ຜົນກະທົບຂອງການຄວບຄຸມ shRNA ແລະ DARS-AS1 shRNA ຕໍ່ກັບການສ້າງອານານິຄົມໃນຈຸລັງ SW620.ການຂະຫຍາຍເຊນ (d), ການສ້າງສະເຟຣອຍ (e), ແລະການສ້າງອານານິຄົມ (f) ຂອງເຊລ SW620 ທີ່ສະແດງອອກເກີນ DARS-AS1.ຂໍ້​ມູນ​ສະ​ແດງ​ໃຫ້​ເຫັນ​ແມ່ນ​ມາດ​ຕະ​ຖານ ± deviation ຂອງ​ສາມ​ການ​ທົດ​ລອງ​.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, ແລະ *** p ≤ 0.001 ໂດຍການທົດສອບ t ຂອງນັກຮຽນສອງຫາງ.
ເພື່ອປະກອບການສຶກສາການສູນເສຍການເຮັດວຽກ, ຕໍ່ໄປ, ພວກເຮົາສ້າງຈຸລັງ SW620 ທີ່ສະແດງອອກເກີນ DARS-AS1 (ຮູບພາບເສີມ 2g).DARS-AS1 overexpression ເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍການຂະຫຍາຍຕົວຂອງເຊນ (1.8-ເທົ່າ), ການສ້າງ spheroid unanchored (1.4-ເທົ່າ), ແລະການສ້າງອານານິຄົມ (3.3-ເທົ່າ) ໃນຈຸລັງ SW620 (ຮູບ 2d-f).ພວກເຮົາໄດ້ຢືນຢັນຜົນໄດ້ຮັບນີ້ໂດຍໃຊ້ DARS-AS1 ເສັ້ນສະແດງເຊນອື່ນ, A549.ການຂະຫຍາຍຈຸລັງທີ່ປັບປຸງນີ້ເນື່ອງຈາກການສະແດງອອກຫຼາຍເກີນໄປຂອງ DARS-AS1 ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນຕື່ມອີກໃນຈຸລັງ A549 (ຮູບພາບເສີມ 2h, i ແລະຕາຕະລາງເສີມ 3).ຮ່ວມກັນ, ການສຶກສາການໄດ້ຮັບແລະການສູນເສຍເຫຼົ່ານີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ DARS-AS1 ສົ່ງເສີມການຂະຫຍາຍຈຸລັງມະເຮັງໃນ vitro.
ເພື່ອຄົ້ນຫາກົນໄກພື້ນຖານທີ່ DARS-AS1 ຄວບຄຸມການຂະຫຍາຍຈຸລັງ, ພວກເຮົາໄດ້ເຮັດການວິເຄາະດຶງລົງ RNA ເພື່ອກໍານົດຄູ່ຮ່ວມງານທີ່ມີທາດໂປຼຕີນທີ່ມີທ່າແຮງຂອງມັນ.ຜົນໄດ້ຮັບຂອງ RT-qPCR ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າປະມານ 86.2% ຂອງ DARS-AS1 ແມ່ນຢູ່ໃນ cytoplasm ຂອງຈຸລັງ SW620 (ຮູບພາບເສີມ 3a).ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ສານ biotinylated transcribed in vitro DARS-AS1 ຫຼື pseudoRNA ໄດ້ຖືກອົບດ້ວຍ SW620 cell lysates ຕາມດ້ວຍການແຍກ SDS-PAGE.ການ staining ເງິນຕໍ່ມາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າແຖບທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (~38 kDa) ໄດ້ຖືກເສີມຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນ DARS-AS1 ດຶງຕົວຢ່າງແຕ່ບໍ່ແມ່ນຢູ່ໃນ dummy RNA ຫຼືຕົວຢ່າງ beads (ຮູບ 3a).ແຖບນີ້ໄດ້ຖືກລະບຸວ່າເປັນ PKR activating protein (PACT) ໂດຍ mass spectrometry (MS) ແລະຢືນຢັນຕື່ມອີກໂດຍການ immunoblotting ໃນ SW620, HCT116, ແລະ HepG2 cell line (ຮູບ 3a,b).ການເສີມສ້າງຂອງ DARS ແລະທາດໂປຼຕີນຈາກ PACT ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ - PKR ແລະ TRBP - ຍັງໄດ້ຖືກສືບສວນໂດຍໃຊ້ການວິເຄາະ RNA ໂດຍ Western blotting (WB).ຜົນໄດ້ຮັບຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າບໍ່ມີປະຕິສໍາພັນໂດຍກົງລະຫວ່າງ DARS-AS1 RNA ແລະທາດໂປຼຕີນທັງສາມນີ້ບໍ່ພົບ (ຕື່ມ Fig. 3b).ປະຕິສໍາພັນສະເພາະລະຫວ່າງ DARS-AS1 ແລະ PACT ໄດ້ຖືກຢືນຢັນຕື່ມອີກໂດຍການວິເຄາະ RNA immunoprecipitation (RIP), ເຊິ່ງສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ DARS-AS1 ແມ່ນອຸດົມໄປດ້ວຍພູມຕ້ານທານຕ້ານ PACT ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍແຕ່ບໍ່ແມ່ນ RNAs ຄວບຄຸມອື່ນໆ (ຮູບ 3c).ເພື່ອກໍານົດວ່າ DARS-AS1 ມີປະຕິກິລິຍາໂດຍກົງກັບ PACT ໃນກໍລະນີທີ່ບໍ່ມີອົງປະກອບຂອງເຊນອື່ນ, ການວິເຄາະ in vitro biolayer interferometry (BLI) ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ PACT ບໍລິສຸດ.Biotin-labeled DARS-AS1 ຫຼື dummy RNA ໄດ້ຖືກ immobilized ໃນ streptavidin (SA) biosensors ແລະຈາກນັ້ນ incubated ໃນ kinetic buffer ທີ່ມີ 1 μM PACT.ໂດຍສະເພາະ, PACT ຜູກມັດຢ່າງແຂງແຮງກັບ DARS-AS1 (ຄ່າ KD ~ 26.9 nM), ແຕ່ບໍ່ໃຫ້ mimic RNA (ຮູບ 3d).ຮ່ວມກັນ, ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນການໂຕ້ຕອບໂດຍກົງແລະຄວາມໃກ້ຊິດສູງລະຫວ່າງ DARS-AS1 ແລະ PACT.
ການວິເຄາະດຶງ RNA ໄດ້ກໍານົດ DARS-AS1 ປະຕິສໍາພັນກັບ PACT ໃນຈຸລັງ SW620.ຂ້າງເທິງ, ສີເງິນຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ.immunoblots ຕ່ໍາໄດ້ຖືກປະຕິບັດດ້ວຍ antibody ຕ້ານ PACT.b ການວິເຄາະດຶງລົງ RNA ໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃນຈຸລັງ HCT116 (ເທິງ) ແລະ HepG2 (ລຸ່ມ).ການເສີມ PACT ໄດ້ຖືກກວດພົບໂດຍ immunoblotting.ການວິເຄາະ cRNA immunoprecipitation (RIP) ໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃນຈຸລັງ SW620 ໂດຍໃຊ້ພູມຕ້ານທານທີ່ລະບຸໄວ້.d PACT ຜູກມັດເສັ້ນໂຄ້ງກັບຄວາມຍາວເຕັມ DARS-AS1 ຫຼື RNA ຄວບຄຸມແມ່ນໄດ້ຮັບໂດຍໃຊ້ biolayer interferometry (BLI).RNA ຖືກກັກຂັງຢູ່ໃນຕົວເຊັນເຊີ streptavidin.1 μM PACT ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອວັດແທກການພົວພັນ.e RNA pull assay ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ biotinylated full-length DARS-AS1 ຫຼືຕັດ (ເທິງ).Immunoblot ສະແດງ PACT ທີ່ໄດ້ຮັບ (ດ້ານລຸ່ມ).f PACT ທຸງທີ່ບໍລິສຸດໄດ້ຖືກອົບດ້ວຍ DARS-AS1 ທີ່ມີຄວາມຍາວເຕັມທີ່ biotinylated ຫຼືຖືກຕັດອອກ (ເຊັ່ນດຽວກັບ e) ສໍາລັບການວິເຄາະໃນ vitro RIP.RNA ສະກັດໄດ້ຖືກກວດສອບໂດຍ RT-qPCR.g ຄວາມຜູກພັນຂອງຊິ້ນສ່ວນ RNA ທີ່ແຕກຕ່າງກັນສໍາລັບ PACT ແມ່ນໄດ້ຮັບໂດຍໃຊ້ biolayer interferometry.ສໍາລັບການວິເຄາະ, 100 nM RNA ແລະ 1 μM RAST ຖືກນໍາໃຊ້.h ການວິເຄາະໃນ vitro RIP ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ PACT ທີ່ບໍລິສຸດຫຼືຖືກຕັດອອກ.RNA ສະກັດໄດ້ຖືກກວດສອບໂດຍ RT-qPCR.i ອັດຕາການຂະຫຍາຍຕົວຂອງເຊວ SW620 ເກີນການສະແດງ DARS-AS1, PACT, ຫຼືທັງສອງ.j ການສະແດງອອກຫຼາຍເກີນໄປຂອງຄວາມຍາວເຕັມຫຼືຕັດ DARS-AS1 ໃນຈຸລັງ SW620 ມີຜົນກະທົບທີ່ແຕກຕ່າງກັນຕໍ່ການຂະຫຍາຍຕົວຂອງເຊນ.k Apoptosis ຖືກກວດພົບໂດຍ immunoblotting ກັບ anti-PARP antibody.l Knockout ຂອງ DARS-AS1 induces apoptosis ຂອງຈຸລັງ SW620 ດັ່ງທີ່ສະແດງໂດຍ flow cytometry.ຂໍ້​ມູນ​ສະ​ແດງ​ໃຫ້​ເຫັນ​ແມ່ນ​ມາດ​ຕະ​ຖານ ± deviation ຂອງ​ສາມ​ການ​ທົດ​ລອງ​. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, ໂດຍການທົດສອບ t ຂອງນັກຮຽນສອງຫາງ. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, ໂດຍການທົດສອບ t ຂອງນັກຮຽນສອງຫາງ. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 ໂດຍ t-test ຂອງນັກຮຽນສອງຫາງ. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 ໂດຍ t-test ຂອງນັກຮຽນສອງຫາງ.
ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ສ້າງຊິ້ນສ່ວນ DARS-AS1 RNA ທີ່ມີ biotinylated ສາມຊິ້ນໂດຍການຖອດຂໍ້ຄວາມໃນ vitro ເພື່ອກໍານົດພາກພື້ນ DARS-AS1 ທີ່ຕ້ອງການສໍາລັບສະມາຄົມ PACT (ຮູບ 3e).ຜົນໄດ້ຮັບການວິເຄາະ RNA ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າແຕ່ລະຊິ້ນສາມາດພົວພັນກັບ PACT, ແຕ່ພາກພື້ນ 3′-terminal (384–768 nucleotides ປ້າຍ A3) ສະແດງໃຫ້ເຫັນຫຼາຍກ່ວາ 1–384 nucleotides ປ້າຍ A1) (ຮູບ 3e).ຜົນໄດ້ຮັບທີ່ຄ້າຍຄືກັນໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນໃນການວິເຄາະ RIP ໃນ vitro ໂດຍໃຊ້ PACT recombinant (ຮູບ 3f).ສອດຄ່ອງກັບຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້, ການທົດລອງທີ່ຈະຜູກມັດຊິ້ນ RNA immobilized ກັບ PACT ໂດຍໃຊ້ BLI ຍັງສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ PACT ມີຄວາມໃກ້ຊິດສູງກວ່າສໍາລັບ A3 (384-768 nt) (KD ປະມານ 94.6 nM), ໃນຂະນະທີ່ເກືອບບໍ່ມີການເຊື່ອມຕໍ່ກັບພື້ນທີ່ອື່ນໆ.(ຮູບ 3d).
ພວກເຮົາຍັງໄດ້ກວດເບິ່ງຂົງເຂດການຜູກມັດທີ່ກ່ຽວຂ້ອງໃນ PACT.PACT ປະກອບມີສາມໂດເມນທີ່ມີປະໂຫຍດ, ສອງອັນແມ່ນໂດເມນທີ່ຜູກມັດ RNA ສອງຊັ້ນທີ່ຖືກຮັກສາໄວ້ (dsRBD) ແລະໂດເມນທີສາມ (ກໍານົດ D3) ທີ່ເຮັດຫນ້າທີ່ເປັນຕົວກະຕຸ້ນການໂຕ້ຕອບຂອງທາດໂປຼຕີນ.ເພື່ອກວດເບິ່ງຄວາມສາມາດໃນການຜູກມັດ lncRNA ຂອງແຕ່ລະໂດເມນ, ພວກເຮົາໄດ້ສ້າງການກາຍພັນສາມອັນທີ່ເອົາແຕ່ລະສາມໂດເມນອອກແລະເຮັດການວິເຄາະໃນ vitro RIP.ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການລຶບໂດເມນທີສາມ (D3) ຂອງ PACT ຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນການໂຕ້ຕອບກັບ DARS-AS1 (ໂດຍ 0.11-ເທົ່າເມື່ອທຽບໃສ່ກັບ PACT ທີ່ບໍ່ມີຕົວຕົນ) ເມື່ອທຽບກັບສອງການກາຍພັນອື່ນໆ (ຮູບ 3h), ມັນໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການປ່ອຍ ຂອງ D3 ໂຕ້ຕອບກັບ DARS.-AC1.ຮ່ວມກັນ, ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າການໂຕ້ຕອບລະຫວ່າງ DARS-AS1 ແລະ PACT ອາດຈະເກີດຂຶ້ນຕົ້ນຕໍໂດຍຜ່ານ 3′ ສິ້ນສຸດຂອງ DARS-AS1 ແລະໂດເມນ D3 ຂອງ PACT.
ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນວ່າ DARS-AS1 ບໍ່ມີຜົນຕໍ່ການສະແດງອອກຂອງ PACT ແລະ PACT ບໍ່ມີຜົນຕໍ່ DARS-AS1 (ຮູບການເສີມ 3c).ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ກວດເບິ່ງຜົນກະທົບຂອງ PACT ຫຼຸດລົງກ່ຽວກັບການເຕີບໂຕຂອງເຊນ.ໃນທາງກົງກັນຂ້າມກັບ DARS-AS1, ຈຸລັງພີ່ນ້ອງຂະຫຍາຍຕົວໄວຂຶ້ນ 1.5–3 ເທົ່າເມື່ອ PACT ລົ້ມລົງ (ຮູບພາບເສີມ. 3d).ຜົນໄດ້ຮັບຂອງການວິເຄາະການສ້າງອານານິຄົມໄດ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າຈຸລັງສ້າງເປັນອານານິຄົມ 2-3 ເທົ່າຫຼັງຈາກການປິ່ນປົວ shRNA ດ້ວຍ PACT (ຕື່ມ Fig. 3e).ເພື່ອທົດສອບວ່າ DARS-AS1 ຄວບຄຸມການຂະຫຍາຍເຊນຜ່ານ PACT, ພວກເຮົາສ້າງເຊລ SW620 ທີ່ສະແດງອອກເກີນ PACT, DARS-AS1, ຫຼືທັງສອງ.ການສະແດງອອກຫຼາຍເກີນໄປຂອງ PACT ສະແດງໃຫ້ເຫັນການຍັບຍັ້ງການຂະຫຍາຍຈຸລັງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (ຮູບ 3i).ໃນຂະນະທີ່ DARS-AS1 overexpression per se ສົ່ງເສີມການຂະຫຍາຍຈຸລັງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ, ບໍ່ມີຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ສໍາຄັນໃນອັດຕາການຂະຫຍາຍຕົວຂອງຈຸລັງ overexpressing DARS-AS1 ແລະ PACT.ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ PACT ອາດຈະຕ້ານການຂະຫຍາຍຕົວທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນທີ່ເກີດຈາກການສະແດງອອກເກີນ DARS-AS1.
ເນື່ອງຈາກພາກພື້ນທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງ DARS-AS1 ມີຄວາມສາມາດຜູກມັດ PACT ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ, ພວກເຮົາຈຶ່ງໄດ້ສືບສວນອິດທິພົນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງຂອງເຂົາເຈົ້າກ່ຽວກັບການຂະຫຍາຍເຊລໂດຍການສະແດງອອກຫຼາຍເກີນໄປຂອງຊິ້ນສ່ວນ DARS-AS1.ເມື່ອປຽບທຽບກັບສອງຊິ້ນອື່ນໆ, DARS-AS1 ໄດ້ຖືກສະແດງອອກເກີນຂອບເຂດ 3′ (384–768 nt), ພາກພື້ນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ PACT ຕົ້ນຕໍໃນ DARS-AS1, ເຊິ່ງມີຄວາມສາມາດສູງສຸດທີ່ຈະກະຕຸ້ນການຂະຫຍາຍຈຸລັງ (ຮູບ 3j).ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມກ່ຽວຂ້ອງໃນທາງບວກລະຫວ່າງຄວາມສາມາດໃນການຜູກມັດແລະການທໍາງານທາງຊີວະພາບຂອງ DARS-AS1.
PACT ໄດ້ຖືກລາຍງານວ່າເປັນທາດໂປຼຕີນຈາກ pro-apoptotic19.ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ສືບສວນຜົນກະທົບຂອງ DARS-AS1 ກ່ຽວກັບ apoptosis.ດັ່ງທີ່ຄາດໄວ້, DARS-AS1 knockdown ເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ PARP cleavage ໃນຈຸລັງ SW620 ແລະເພີ່ມອັດຕາສ່ວນຂອງຈຸລັງ annexin V-positive ໃນ SW620, HCT116, HepG2, ແລະ MBA-MD-231 cell line (ຮູບ 3k).3).3f–h), ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າຜົນກະທົບຕ້ານ apoptotic ຂອງ DARS-AS1 ໃນຈຸລັງມະເຮັງແມ່ນກົງກັນຂ້າມກັບຫນ້າທີ່ກະຕຸ້ນ apoptosis ຂອງ PACT.ຮ່ວມກັນ, ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າກົນໄກຂອງການເຮັດວຽກຂອງ oncogenic DARS-AS1 ອາດຈະໄດ້ຮັບການຍັບຍັ້ງການເຮັດວຽກຂອງ PACT.
ຕໍ່ໄປ, ພວກເຮົາສຳຫຼວດຜົນກະທົບທີ່ເປັນປະໂຫຍດຂອງສະມາຄົມ DARS-AS1-PACT.PACT ໄດ້ຖືກລາຍງານວ່າເປີດໃຊ້ PKR ຜ່ານການໂຕ້ຕອບໂດຍກົງ, ເຊິ່ງຕໍ່ມາເສີມຂະຫຍາຍ eIF2α phosphorylation, ເຊິ່ງກໍ່ໃຫ້ເກີດການລຶບການແປພາສາແລະ apoptosis17.ທໍາອິດ, ພວກເຮົາໄດ້ກວດເບິ່ງວ່າ DARS-AS1 ມີຜົນກະທົບຕໍ່ການທ້ອງຖິ່ນຂອງໂທລະສັບມືຖືຂອງ PACT ແລະ PKR.ກ້ອງຈຸລະທັດ fluorescence Confocal ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ PACT ແລະ PKR ໄດ້ຖືກ colocalized ສູງໃນຈຸລັງ SW620 ດ້ວຍຄ່າສໍາປະສິດການພົວພັນ Pearson ສະເລ່ຍຂອງ 0.72.ໃນຂະນະດຽວກັນ, DARS-AS1 overexpression ຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ PACT ແລະ PKR co-localization (ຫມາຍຄວາມວ່າ Pearson correlation coefficient 0.61) (ຮູບ 4a).ເພື່ອສືບສວນວ່າ DARS-AS1 ສາມາດປັບປ່ຽນປະຕິສໍາພັນ PACT-PKR, ພວກເຮົາໄດ້ເຮັດການວິເຄາະຮ່ວມ immunoprecipitation (co-IP) ກັບ anti-PACT ແອນຕິບໍດີໃນ SW620 cell lysates.PKR ແມ່ນອຸດົມໄປດ້ວຍສານຕ້ານການ PACT ໃນຈຸລັງຄວບຄຸມ, ໃນຂະນະທີ່ການຟື້ນຕົວຂອງ PKR ໄດ້ຖືກຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນ lysates ຈາກຈຸລັງທີ່ overexpressing DARS-AS1 (ຮູບ 4b).PACT ແລະ PKR ທີ່ມີສະຫຼາກທີ່ບໍລິສຸດໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການວິເຄາະການຜູກມັດທາດໂປຼຕີນໃນ vitro.ດັ່ງນັ້ນ, ຜູ້ທີ່ສະຫນອງ DARS-AS1 ແຕ່ບໍ່ມີ RNA ຄວບຄຸມໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນປະຕິສໍາພັນ PACT-PKR ສະກັດກັ້ນ (ຮູບ 4c).ຜົນໄດ້ຮັບທັງຫມົດສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ DARS-AS1 ຂັດຂວາງການສື່ສານ PACT ແລະ PKR.
ການຕັ້ງຖິ່ນຖານຮ່ວມກັນຂອງ PACT ແລະ PKR ໃນຈຸລັງຄວບຄຸມຫຼືຈຸລັງທີ່ສະແດງອອກເກີນ DARS-AS1 ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນໂດຍໃຊ້ກ້ອງຈຸລະທັດ fluorescence confocal.ນິວເຄລຍໄດ້ຖືກເປື້ອນດ້ວຍ DAPI.ຜົນສະຖິຕິໄດ້ມາຈາກ 16 ຮູບຖ່າຍ.b Co-immunoprecipitation (co-IP) ໂດຍໃຊ້ anti-PACT antibody ໃນ cell lysates ຂອງຈຸລັງຄວບຄຸມ SW620 ຫຼືຈຸລັງ overexpressing DARS-AS1.c ປ້າຍກຳກັບ PACT, PKR ບໍລິສຸດ ແລະຖ່າຍທອດໃນ vitro ດ້ວຍ DARS-AS1 ຫຼື mock RNA ໄດ້ຖືກອົບເພື່ອການວິເຄາະການຜູກມັດທາດໂປຼຕີນໃນ vitro.ພູມຕ້ານທານຕ້ານທຸງໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການ immunoprecipitation.d Immunoblots ທີ່ມີພູມຕ້ານທານທີ່ລະບຸໄວ້ໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃນຈຸລັງ SW620 ແລະ HCT116 ທີ່ຖືກຖ່າຍທອດດ້ວຍການຄວບຄຸມ shRNA ຫຼື DARS-AS1-shRNA ຕິດຕາມດ້ວຍ serum starvation.e ລະດັບການສະແດງອອກຂອງ DARS-AS1 ປ່ຽນແປງຄວາມອ່ອນໄຫວຂອງເຊນໃຫ້ກັບ thapsigargin.ຈຸລັງ SW620 ຖືກຖ່າຍທອດດ້ວຍ DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 overexpression plasmid ຫຼື plasmid ຄວບຄຸມ.ຈຸລັງໄດ້ຖືກປະຕິບັດດ້ວຍ thapsigargin ເປັນເວລາ 48 ຊົ່ວໂມງແລະຄວາມເປັນໄປໄດ້ຂອງເຊນແມ່ນຖືກກໍານົດໂດຍໃຊ້ MTS reagent.f in vitro transcribed DARS-AS1 ຫຼື dummy RNA ແລະ PACT ບໍລິສຸດໄດ້ຖືກໃຊ້ສໍາລັບການວິເຄາະການກະຕຸ້ນໃນ vitro ແລະການກວດຫາພູມຕ້ານທານ.g Immunoblots ໂດຍໃຊ້ພູມຕ້ານທານເຫຼົ່ານີ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃນເຊນ SW620-ctrl (ຊ້າຍ) ຫຼືຈຸລັງທີ່ສະແດງອອກເກີນ PKR mutants (ຂວາ).ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຈຸລັງເຫຼົ່ານີ້ຖືກຖ່າຍທອດດ້ວຍ shRNA ຄວບຄຸມຫຼື DARS-AS1-shRNA ປະຕິບັດຕາມໂດຍການຫິວນ້ໍາ serum.h Flow cytometry ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການ inactivation ຂອງ PKR mutant ໄດ້ຊົດເຊີຍສໍາລັບ apoptosis ທີ່ກະຕຸ້ນ DARS-AS1 ໃນຈຸລັງ SW620.i Immunoblots ທີ່ມີພູມຕ້ານທານທີ່ລະບຸໄວ້ໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃນຈຸລັງ SW620 (ຊ້າຍ) ຫຼື HCT116 (ຂວາ).ເຊລທີ່ຖືກຖ່າຍທອດດ້ວຍ shRNA ຄວບຄຸມ ຫຼື DARS-AS1 shRNA ແມ່ນຂາດເຊລັມ ແລະ ເສີມດ້ວຍ 100 nM PKR C16 inhibitor ຫຼື DMSO.ແຖບຂະໜາດ = 5 µm.ຂໍ້​ມູນ​ສະ​ແດງ​ໃຫ້​ເຫັນ​ແມ່ນ​ມາດ​ຕະ​ຖານ ± deviation ຂອງ​ສາມ​ການ​ທົດ​ລອງ​.* p ≤ 0.05 two-tailed Student's t-test.
ມັນເຊື່ອວ່າໂດຍທົ່ວໄປແລ້ວເມື່ອ PACT ພົວພັນກັບ PKR17, PKR phosphorylation ຢູ່ Thr451 ສາມາດຖືກກະຕຸ້ນ.ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າລະດັບຂອງ PKR phosphorylation ສູງຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນຈຸລັງ DARS-AS1 knockdown ຫຼັງຈາກ serum starvation (ຮູບ 4d ແລະເສີມ Fig. 4a).ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາພົບເຫັນວ່າ phosphorylation ຂອງ eIF2α, ຕົ້ນຕໍ PKR substrate, ຍັງເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໂດຍ DARS-AS1 shRNA (ຮູບ 4d ແລະເສີມ Fig. 4a).Thapsigargin ແມ່ນຄວາມກົດດັນ ER ທີ່ເຮັດໃຫ້ ER ປ່ອຍ Ca2+.ການປິ່ນປົວກັບ thapsigargin ໄດ້ຖືກລາຍງານເພື່ອກະຕຸ້ນການສະແດງອອກແລະການກະຕຸ້ນຂອງ PACT, ເຊິ່ງພົວພັນກັບແລະກະຕຸ້ນ PKR, ນໍາໄປສູ່ການ apoptosis ໂດຍການເພີ່ມ eIF2α phosphorylation 18,61.ທີ່ນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ thapsigargin ເປັນການກະຕຸ້ນຂອງເສັ້ນທາງ PACT/PKR ເພື່ອສືບສວນວ່າ DARS-AS1 ສາມາດຊ່ວຍໃຫ້ຈຸລັງເອົາຊະນະຄວາມກົດດັນໂດຍການຂັດຂວາງເສັ້ນທາງ PACT/PKR.ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນວ່າລະດັບການສະແດງອອກ DARS-AS1 ມີຄວາມສໍາພັນທາງບວກກັບການຕໍ່ຕ້ານເຊລຕໍ່ thapsigargin.ຈຸລັງ SW620 overexpressing DARS-AS1 ລອດຊີວິດດີຂຶ້ນເມື່ອໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ thapsigargin, ໃນຂະນະທີ່ຈຸລັງທີ່ມີ DARS-AS1 knockdown ກາຍເປັນຄວາມອ່ອນໄຫວຫຼາຍຂຶ້ນ (ຮູບ 4e).ສອດຄ່ອງກັບຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້, DARS-AS1 overexpression ຫຼຸດລົງ thapsigargin-induced PKR phosphorylation (ຕື່ມ Fig. 4b).ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ຫຼັງຈາກການປິ່ນປົວ thapsigargin, PKR ແລະ eIF2α ໄດ້ຖືກ phosphorylated ໃນຂອບເຂດທີ່ສູງຂຶ້ນໃນຈຸລັງ knockdown DARS-AS1 ເມື່ອທຽບກັບຈຸລັງຄວບຄຸມ (ຕື່ມ Fig. 4b).ຫນ້າສົນໃຈ, thapsigargin induced ການສະແດງອອກ DARS-AS1 ໃນລັກສະນະທີ່ຂຶ້ນກັບປະລິມານ, ເຊິ່ງອາດຈະຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງຫນ້າທີ່ຕ້ານຄວາມກົດດັນຂອງ DARS-AS1 (ຕື່ມ Fig. 4c).ນອກຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດການທົດສອບການກະຕຸ້ນໃນ vitro ເພື່ອຢືນຢັນການສັງເກດການເຫຼົ່ານີ້.ໂດຍຫຍໍ້, PKR ໄດ້ຖືກຊໍາລະຈາກ lysates ຈຸລັງໂດຍໃຊ້ anti-PKR antibody, ຫຼັງຈາກນັ້ນ incubated ກັບ recombinant PACT ແລະ DARS-AS1 transcribed in vitro.ຫຼັງຈາກປະຕິກິລິຍາ enzymatic, phospho-PKR ຖືກກວດພົບໂດຍໃຊ້ WB.ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ PKR phosphorylation ຖືກຍັບຍັ້ງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໂດຍ DARS-AS1, ແຕ່ບໍ່ແມ່ນໂດຍ RNA ຄວບຄຸມ (ຮູບ 4f).ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຢູ່ໃນ vitro ແລະໃນ vivo ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ DARS-AS1 ຍັບຍັ້ງການເປີດໃຊ້ PACT-mediated PKR.ໃນຂະນະດຽວກັນ, ພວກເຮົາຍັງໄດ້ສັງເກດເຫັນການຫຼຸດລົງຂອງການຟື້ນຕົວຂອງ PACT ໃນການປະກົດຕົວຂອງ DARS-AS1 (ຮູບ 4f).ຜົນໄດ້ຮັບນີ້ແມ່ນສອດຄ່ອງກັບຜົນໄດ້ຮັບຂອງການວິເຄາະການຜູກມັດທາດໂປຼຕີນໃນ vitro (ຮູບ 4c) ແລະອີກເທື່ອຫນຶ່ງສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງຫນ້າທີ່ສະກັດຂອງ DARS-AS1 ສໍາລັບສະມາຄົມ PACT-PKR.
Ser246 ແລະ Ser287 ໃນໂດເມນ D3 ຂອງ PACT ແມ່ນຕ້ອງການສໍາລັບການເປີດໃຊ້ PKR ພາຍໃຕ້ຄວາມກົດດັນຂອງເຊນ.ການທົດແທນສອງສານຕົກຄ້າງ serine ສໍາລັບ alanine ໄດ້ໃຫ້ mutant PACT (mutD), ເຊິ່ງກະຕຸ້ນ PKR ໃນກໍລະນີທີ່ບໍ່ມີຄວາມກົດດັນ, ແລະການທົດແທນສໍາລັບ alanine (mutA) ໄດ້ປະຕິເສດອະນຸສັນຍາ.ນັບຕັ້ງແຕ່ພວກເຮົາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມສໍາຄັນຂອງໂດເມນນີ້ໃນການພົວພັນໂດຍກົງກັບ DARS-AS1, ພວກເຮົາໄດ້ສ້າງຕົວປ່ຽນ PACT ສອງອັນນີ້ເພື່ອທົດສອບວ່າສານຕົກຄ້າງເຫຼົ່ານີ້ສາມາດພົວພັນກັບ DARS-AS1 ຫຼືບໍ່.ຫນ້າສົນໃຈ, ທັງສອງ mutants ໄດ້ສູນເສຍຄວາມສາມາດໃນການຜູກມັດກັບ DARS-AS1 (ຕື່ມ Fig. 4d), ແນະນໍາວ່າໂຄງສ້າງທີ່ສົມບູນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ PACT ອາດຈະຕ້ອງການສໍາລັບການໂຕ້ຕອບທີ່ມີປະສິດທິພາບກັບ DARS-AS1.
ນອກຈາກນັ້ນ, ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາຍັງແນະນໍາວ່າການຍັບຍັ້ງການຂະຫຍາຍເຊນທີ່ຖືກກະຕຸ້ນໂດຍ DARS-AS1-shRNA ສາມາດຟື້ນຟູໄດ້ບາງສ່ວນໂດຍການສະແດງອອກເກີນ PACT mutant (PACTmutA) ດ້ານລົບທີ່ເດັ່ນຊັດຫຼື PKR mutant (PKRmut) ດ້ານລົບທີ່ເດັ່ນຊັດ (ຮູບພາບເສີມ 4e. e).ການສະແດງອອກຫຼາຍເກີນໄປຂອງ mutants PKR ເດັ່ນ-ລົບຫຼຸດລົງ PKR phosphorylation ກະຕຸ້ນໂດຍ DARS-AS1 knockdown ເຊັ່ນດຽວກັນກັບ eIF2α phosphorylation ໃນເຊລທີ່ຂາດເລືອດ (ຮູບ 4g).ສິ່ງທີ່ສໍາຄັນກວ່ານັ້ນ, ອັດຕາສ່ວນຂອງຈຸລັງ apoptotic induced ໂດຍ DARS-AS1 knockdown ຍັງຖືກຫຼຸດລົງໃນຈຸລັງທີ່ overexpressing PKRmut (ຮູບ 4h ແລະ Supplementary Fig. 4g).ການຍັບຍັ້ງກິດຈະກໍາ PKR kinase ຍັງຂັດຂວາງການເຮັດວຽກຂອງ DARS-AS1, ເນື່ອງຈາກຜົນໄດ້ຮັບສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ DARS-AS1 knockdown ບໍ່ຄ່ອຍຈະເຮັດໃຫ້ເກີດ PKR ແລະ eIF2α phosphorylation ເມື່ອຈຸລັງໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ PKR-specific C16 inhibitor (ຮູບ 4i ແລະຮູບພາບເສີມ 4h).).ຮ່ວມກັນ, ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາແນະນໍາວ່າ DARS-AS1 ສົ່ງເສີມການຂະຫຍາຍຈຸລັງ, ຢ່າງຫນ້ອຍໃນບາງສ່ວນ, ໂດຍການຍັບຍັ້ງການກະຕຸ້ນ PACT-mediated PKR.
ເພື່ອຄົ້ນຫາບົດບາດຂອງ DARS-AS1 ໃນ tumorigenesis ຕື່ມອີກ, ພວກເຮົາໄດ້ເຮັດການທົດລອງ vivo ໂດຍໃຊ້ຕົວແບບ xenograft ຫນູ. ຜົນໄດ້ຮັບສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການຫຼຸດລົງຂອງ DARS-AS1 ຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍການຂະຫຍາຍຕົວ tumor ໃນຫນູ (p value < 0.0001) (ຮູບ 5a). ຜົນໄດ້ຮັບສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການຫຼຸດລົງຂອງ DARS-AS1 ຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍການຂະຫຍາຍຕົວ tumor ໃນຫນູ (p value < 0.0001) (ຮູບ 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. ຜົນໄດ້ຮັບສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ DARS-AS1 knockdown ຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍການຂະຫຍາຍຕົວ tumor ໃນຫນູ (p value < 0.0001) (ຮູບ 5a).结果表明，DARS-AS1的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）.结果表明，DARS-AS1的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）. Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001). ຜົນໄດ້ຮັບສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ DARS-AS1 knockdown ຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍການຂະຫຍາຍຕົວ tumor ໃນຫນູ (p value < 0.0001) (ຮູບ 5a).ດັ່ງນັ້ນ, ໃນກຸ່ມ DARS-AS1 knockdown, ມີການຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຂອງປະລິມານເນື້ອງອກສະເລ່ຍປະມານ 72.9% ແລະສະເລ່ຍຂອງເນື້ອງອກປະມານ 87.8% (ຮູບ 5b-d).ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນຢ່າງແຂງແຮງວ່າ DARS-AS1 ສາມາດສົ່ງເສີມການເຕີບໂຕຂອງເນື້ອງອກໃນ vivo ໄດ້ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ.
ຜົນກະທົບຂອງການໂຄສະນາ DARS-AS1 ລົ້ມລົງຕໍ່ກັບການເກີດມະເຮັງຜິວໜັງໃນໜູເປືອຍກາຍ.ເສັ້ນໂຄ້ງການຂະຫຍາຍຕົວ (a), ຂະຫນາດ tumor (b), ນ້ໍາຫນັກ (c), ແລະຮູບພາບ tumor (d) ແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນ.ແຖບຄວາມຜິດພາດເປັນຕົວແທນ ±SEM. n = 10. ****p < 0.0001, ໂດຍການທົດສອບ t ຂອງນັກຮຽນສອງຫາງ. n = 10. ****p < 0.0001, ໂດຍການທົດສອບ t ຂອງນັກຮຽນສອງຫາງ. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 t-test ຂອງນັກຮຽນສອງຫາງ.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验. ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 t-test ຂອງນັກຮຽນສອງຫາງ.e Kaplan-Meier ວິເຄາະຄວາມສໍາພັນລະຫວ່າງລະດັບການສະແດງອອກ DARS-AS1 ແລະການຢູ່ລອດໂດຍລວມໃນຄົນເຈັບທີ່ມີ UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, ແລະ LGG.ລະດັບສູງຂອງການສະແດງອອກ DARS-AS1 ໃນຄົນເຈັບແມ່ນຢູ່ໃນ 50% ສູງສຸດ;ລະດັບຕ່ໍາຂອງການສະແດງອອກ DARS-AS1 ໃນຄົນເຈັບແມ່ນຢູ່ໃນຕ່ໍາສຸດ 50%.p-values ​​ຖືກກໍານົດໂດຍໃຊ້ການທົດສອບການຈັດອັນດັບບັນທຶກ.f ຮູບແບບທີ່ສະເຫນີທີ່ DARS-AS1 ຄວບຄຸມເສັ້ນທາງ PACT-PKR ແລະການຂະຫຍາຍຕົວຂອງເນື້ອງອກ.
ເພື່ອເຂົ້າໃຈຜົນກະທົບທາງດ້ານຄລີນິກຂອງ DARS-AS1, ພວກເຮົາໄດ້ກວດເບິ່ງຄວາມກ່ຽວຂ້ອງກັນລະຫວ່າງການສະແດງອອກຂອງມັນແລະການຢູ່ລອດຂອງຄົນເຈັບ.ໂດຍການວິເຄາະຊຸດຂໍ້ມູນ TCGA, ພວກເຮົາພົບວ່າການສະແດງອອກຂອງ DARS-AS1 ສູງກວ່າແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງກັບ uveal melanoma (UVM), chromophobia renal (KICH), renal papillary cell carcinoma (KIRP), mesothelioma (MESO), multiplex.ການຢູ່ລອດຕ່ໍາແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍກັບ glioblastoma morphosis (GBM) ແລະຄົນເຈັບທີ່ມີ glioma ສະຫມອງຕ່ໍາ (LGG) (ຮູບ 5e).ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ DARS-AS1 ອາດຈະມີບົດບາດສໍາຄັນໃນຄວາມຄືບຫນ້າຂອງເນື້ອງອກທາງດ້ານຄລີນິກແລະອາດຈະເປັນຕົວຊີ້ບອກທາງຊີວະພາບທີ່ມີທ່າແຮງໃນມະເຮັງຫຼາຍຊະນິດ.
ໃນການສຶກສານີ້, ໂດຍໃຊ້ CRISPRi ການກວດສອບຂະຫນາດໃຫຍ່, ພວກເຮົາໄດ້ກໍານົດວ່າ DARS-AS1 lncRNA ເອົາຊະນະຄວາມກົດດັນຂອງເຊນມະເຮັງໂດຍການຄວບຄຸມສອງຕົວຕອບສະຫນອງຄວາມກົດດັນທີ່ສໍາຄັນ, PACT ແລະ PKR.ໂດຍການໂຕ້ຕອບໂດຍກົງກັບ PACT, DARS-AS1 ຍັບຍັ້ງການກະຕຸ້ນ PACT-mediated PKR, ດັ່ງນັ້ນການປ້ອງກັນການຕາຍຂອງເຊນ apoptotic ແລະສົ່ງເສີມການຂະຫຍາຍຈຸລັງ (ຮູບ 5f).Upregulation ຂອງ DARS-AS1 ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນຫຼາຍປະເພດຂອງມະເຮັງ, ແນະນໍາວ່າຫນ້າທີ່ຂອງຕົນໃນການສົ່ງເສີມການຢູ່ລອດຂອງເຊນມະເຮັງພາຍໃຕ້ສະພາບຄວາມກົດດັນອາດຈະຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງກັບມະເຮັງຫຼາຍຊະນິດ.
PACT ໄດ້ຖືກລະບຸວ່າເປັນໂປຣຕີນຕົວກະຕຸ້ນ PKR, ແລະການກະຕຸ້ນ PKR ທີ່ເປັນກາງຂອງ PACT ມີບົດບາດສໍາຄັນໃນການຕອບສະຫນອງຄວາມກົດດັນໂດຍການຄວບຄຸມການຖອດຂໍ້ຄວາມ, ການແປ, apoptosis, ແລະຂະບວນການ cellular ທີ່ສໍາຄັນອື່ນໆ62.ເປັນເວລາຫຼາຍທົດສະວັດແລ້ວ, ມີຄວາມພະຍາຍາມທີ່ຈະເຂົ້າໃຈກົດລະບຽບສະເພາະຂອງມະເຮັງຂອງ PACT-PKR cascade.ທີ່ນີ້, ການສຶກສາຂອງພວກເຮົາໄດ້ເປີດເຜີຍກົນໄກທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງລະບຽບການຂອງ PACT-PKR ໃນຈຸລັງມະເຮັງໂດຍຜ່ານຈຸລັງ lncRNA DARS-AS1, ເຊິ່ງຜູກມັດໂດຍກົງກັບ PACT, ສະກັດກັ້ນການໂຕ້ຕອບ PACT-PKR, ຍັບຍັ້ງການກະຕຸ້ນ PKR ແລະ eIF2α phosphorylation, ດັ່ງນັ້ນການຍັບຍັ້ງ apoptosis ທີ່ເຮັດໃຫ້ເກີດຄວາມກົດດັນແລະ. ກະຕຸ້ນການຂະຫຍາຍຕົວຂອງມະເຮັງໃນທີ່ສຸດ.ຈຸລັງ.ການຄົ້ນພົບນີ້ເຮັດໃຫ້ແສງສະຫວ່າງກ່ຽວກັບເປົ້າຫມາຍ lncRNA ທີ່ມີທ່າແຮງສໍາລັບການຄາດຄະເນແລະການປິ່ນປົວມະເຮັງ.
ຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ DARS-AS1 knockdown sensitizes ຈຸລັງໄປສູ່ຄວາມອຶດຫິວ serum ດ້ວຍການເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຂອງ phosphorylated PKR ແລະ eIF2α.ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ DARS-AS1 ສົ່ງເສີມການຢູ່ລອດຂອງເຊນມະເຮັງພາຍໃຕ້ສະພາບທີ່ຮຸນແຮງໂດຍການຍັບຍັ້ງກິດຈະກໍາ PACT/PKR.RNAs ທີ່ບໍ່ແມ່ນລະຫັດອື່ນໆຈໍານວນຫນຶ່ງ, ເຊັ່ນ: ASPACT ແລະ nc886, ຍັງມີສ່ວນກ່ຽວຂ້ອງກັບແກນ PACT/PKR ໂດຍການຫຼຸດ PACT48 mRNA ຫຼືຄວບຄຸມ autophosphorylation ໂດຍການຜູກມັດກັບ PKR49,50,64.ໃນບັນດາພວກເຂົາ, DARS-AS1 ເຮັດຫນ້າທີ່ເປັນການລົບກວນຂອງສະມາຄົມ PACT-PKR.ການສຶກສານີ້ເພີ່ມຄວາມເຂົ້າໃຈຂອງພວກເຮົາກ່ຽວກັບກົດລະບຽບແກນ PACT/PKR ແລະບົດບາດຂອງ lncRNAs ໃນການຕອບສະຫນອງຄວາມກົດດັນ.
PACT ມີສາມໂດເມນແຍກຕ່າງຫາກ.ແຕ່ລະ dsRBD ສອງອັນທໍາອິດແມ່ນພຽງພໍເພື່ອບັນລຸການຜູກມັດສູງຂອງ PACT ກັບ PKR, ໃນຂະນະທີ່ໂດເມນທີສາມ (D3) ແມ່ນຕ້ອງການສໍາລັບການເປີດໃຊ້ PKR ໃນ vitro ແລະ in vivo.ການສຶກສາຂອງພວກເຮົາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ DARS-AS1 ມັກຈະພົວພັນກັບໂດເມນ D3 (ຮູບ 3h).ເນື່ອງຈາກຂະຫນາດຂະຫນາດໃຫຍ່ຂອງ lncRNA (768 nucleotides), ການຜູກມັດ DARS-AS1 ກັບ D3 ສາມາດຍັບຍັ້ງປະຕິສໍາພັນລະຫວ່າງໂດເມນ PACT ຂອງ dsRBD ແລະ PKR, ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງຂັດຂວາງການເຊື່ອມໂຍງຂອງ PACT ແລະ PKR.ການກາຍພັນຂອງຈຸດ PACT ທີ່ປ່ຽນແທນ Ser246 ແລະ Ser287 ໃນ D3 ດ້ວຍ alanine ຫຼື aspartate ຂັດຂວາງຄວາມຜູກພັນຂອງມັນສໍາລັບ DARS-AS1, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມສໍາຄັນຂອງໂຄງສ້າງແລະໂຄງສ້າງໄຟຟ້າໂດຍລວມຂອງ D3 ໃນສະມາຄົມຂອງພວກເຂົາ.ລາຍລະອຽດເພີ່ມເຕີມຂອງກົນໄກນີ້ຈະມີຄວາມຈໍາເປັນໃນອະນາຄົດ, ການນໍາໃຊ້ການວິເຄາະທາງຊີວະເຄມີທີ່ຊັດເຈນກວ່າແລະການວິເຄາະໂຄງສ້າງ PACT ທີ່ມີຄວາມລະອຽດສູງ.
ການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາໄດ້ລາຍງານວ່າ DARS-AS1 ສົ່ງເສີມການຂະຫຍາຍຈຸລັງໂດຍຜ່ານກົນໄກຫຼາຍອັນ 51,52,53.ໃນຕົວຢ່າງຫນຶ່ງ, ນັກສືບສວນໄດ້ສັງເກດເຫັນວ່າ DARS-AS1 ປັບປຸງ gene antisense protein-encoding DARS ຂອງມັນໂດຍການກໍາຫນົດເປົ້າຫມາຍ miP-194-5p ໃນຈຸລັງມະເຮັງຫມາກໄຂ່ຫຼັງ.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ໃນການສຶກສາໃນປະຈຸບັນ, DARS-AS1 knockdown ມີຜົນກະທົບເລັກນ້ອຍຕໍ່ການຖ່າຍທອດ DARS ໃນຫຼາຍໆຊະນິດຂອງມະເຮັງ, ລວມທັງມະເຮັງລໍາໄສ້ໃຫຍ່, ເຕົ້ານົມ, ແລະມະເຮັງຕັບຢ່າງຫນ້ອຍ.ເນື່ອງຈາກວ່າ lncRNAs ສະແດງຮູບແບບການສະແດງອອກສະເພາະຂອງຈຸລັງແລະເນື້ອເຍື່ອ, ກົນໄກການທໍາງານອາດຈະບໍ່ໄດ້ຮັບການອະນຸລັກໃນທົ່ວປະເພດມະເຮັງ, ເຊິ່ງອາດຈະເຮັດໃຫ້ຄວາມແຕກຕ່າງລະຫວ່າງການສັງເກດການຂອງພວກເຮົາແລະການປະເມີນທີ່ຜ່ານມາຂອງມະເຮັງທີ່ແຕກຕ່າງກັນ.ການສຶກສາພິເສດແມ່ນຈໍາເປັນເພື່ອອະທິບາຍກົນໄກສະເພາະຂອງຂະບວນການ Physiological ແລະ pathological ຕ່າງໆ.
ການວິເຄາະຂໍ້ມູນທາງດ້ານຄລີນິກໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການສະແດງອອກຂອງ DARS-AS1 ໃນເນື້ອງອກມີຄວາມສໍາພັນກົງກັນຂ້າມກັບການຢູ່ລອດຂອງຄົນເຈັບທີ່ເປັນມະເຮັງ, ເຊິ່ງຊີ້ໃຫ້ເຫັນຄວາມສໍາຄັນຂອງແກນ DARS-AS1/PACT/PKR ໃນການພະຍາກອນມະເຮັງ.ສະຫຼຸບແລ້ວ, ການສຶກສາຂອງພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ DARS-AS1 ເປັນຕົວຄວບຄຸມຂອງແກນສັນຍານ PACT/PKR, ສົ່ງເສີມການຂະຫຍາຍຕົວຂອງເຊນມະເລັງ, ແລະຍັບຍັ້ງ apoptosis ໃນລະຫວ່າງການຕອບສະຫນອງຄວາມກົດດັນ, ເຊິ່ງສະຫນອງການຄົ້ນຄ້ວາອີກອັນຫນຶ່ງແລະມີຄວາມສົນໃຈສໍາລັບການຄົ້ນຄວ້າໃນອະນາຄົດໃນການປິ່ນປົວທີ່ມີທ່າແຮງ. .
ເສັ້ນຈຸລັງຂອງມະນຸດ SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 ແລະ HEK293T ແມ່ນໄດ້ມາຈາກໂຄງສ້າງພື້ນຖານຊັບພະຍາກອນສາຍເຊລແຫ່ງຊາດໃນປະເທດຈີນ.ຈຸລັງທັງຫມົດຖືກຮັກສາໄວ້ໃນຂະຫນາດກາງ DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ເສີມດ້ວຍ 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) ແລະ 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) ທີ່ 37 ° C, 5% CO2.ຕູ້ອົບ.
ຕ້ານ PACT, Abcam (ab31967);ຕ້ານ PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);ຕ້ານທຸງ, Abcam (ab125243);ຕ້ານ eIF2α, Abcam (A0764));ຕ້ານ eIF2α (phosphorus S51), Abcam (ab32157);ຕ້ານ PACT (phosphorus S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);ຫນູປົກກະຕິ IgG, CST (5415S);ກະຕ່າຍປົກກະຕິ IgG, CST (2729S).ພູມຕ້ານທານໄດ້ຖືກເຈືອຈາງ 1: 1000 ໃນ PBST ສໍາລັບການ blotting ຕາເວັນຕົກແລະ 1: 100 ສໍາລັບ IP.
sgRNAs ໄດ້ຖືກພັດທະນາໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງມືທີ່ມີສາທາລະນະທີ່ເອີ້ນວ່າ CRISPR-ERA66.ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ຕົວກໍານົດເຄື່ອງມືເລີ່ມຕົ້ນສໍາລັບການພັດທະນາ sgRNA ແລະລະບົບການຄິດໄລ່ສະຖານທີ່ຜູກມັດ sgRNA ໃນພາກພື້ນ 3 kb.ສູນກາງຢູ່ທີ່ TSS.ສະນຸກເກີຂອງ sgRNA oligonucleotides ໄດ້ຖືກສັງເຄາະຢູ່ທີ່ CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) ແລະ cloned ເຂົ້າໄປໃນ humanized pgRNA plasmids (Addgene #44248).ທັງໝົດ 12 µg ຂອງ pgRNA plasmid humanized, 7.2 µg ຂອງ psPAX2 (Addgene #12260), ແລະ 4.8 µg ຂອງ pMD2.G (Addgene #12259) ໄດ້ຖືກຖ່າຍທອດຮ່ວມກັນເຂົ້າໄປໃນຖ້ວຍ 5 x 106 HEK293T ໃນ 10 μgຂອງ DNA Transfection. ຈຸລັງ (CWBIO, ປັກກິ່ງ, ຈີນ) ປະຕິບັດຕາມຄໍາແນະນໍາຂອງຜູ້ຜະລິດ.supernatants ທີ່ມີເຊື້ອໄວຣັສໄດ້ຖືກເກັບກໍາ 48 ແລະ 72 ຊົ່ວໂມງຫຼັງຈາກການຖ່າຍທອດແລະການກັ່ນຕອງຜ່ານການກັ່ນຕອງ 0.45 µm.ສໍາລັບການກວດ, ຈຸລັງ SW620 ທີ່ສະແດງທາດໂປຼຕີນຈາກ dCas9/KRAB fusion ແມ່ນໄດ້ຮັບໂດຍການຖ່າຍທອດເຊື້ອໄວຣັສ.ຈຸລັງ SW620 ທີ່ຖືກດັດແປງໄດ້ຖືກຕິດເຊື້ອໃນຫ້ອງສະຫມຸດໄວຣັດໃນສີ່ການທົດລອງການຕິດເຊື້ອເອກະລາດຢູ່ທີ່ MOI ຂອງ 0.1-0.3 ແລະຖືກເກັບຕົວຢ່າງດ້ວຍ 2 μg / ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) ເປັນເວລາ 2 ມື້.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຈຸລັງໄດ້ຖືກປູກຝັງເປັນເວລາ 18 ມື້ໃນ vitro ໂດຍມີການຄຸ້ມຄອງຫ້ອງສະຫມຸດຕໍາ່ສຸດທີ່ 500 ຈຸລັງ / sgRNA ສໍາລັບການກວດສອບ.
DNA Genomic ຖືກສະກັດອອກຕາມຄໍາແນະນໍາຂອງ QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, ເຢຍລະມັນ; 51183).ໃນຈໍານວນທັງຫມົດ, 100 μgຂອງ DNA ພັນທຸ ກຳ ຕໍ່ການເຮັດເລື້ມຄືນທາງຊີວະພາບໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອສ້າງຫ້ອງສະຫມຸດ.ພາກພື້ນ sgRNA ໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍໂດຍສອງຮອບຂອງ PCR ແລະເຊື່ອມຕໍ່ກັບ barcode.
ຜະລິດຕະພັນ PCR ໄດ້ຖືກຊໍາລະໂດຍນໍາໃຊ້ NucleoSpin® gel ແລະ PCR purification ຊຸດ (MACHEREY-NAGEL, Düren, ເຢຍລະມັນ; 740609.250) ແລະກໍານົດປະລິມານໂດຍໃຊ້ Qubit™ HS double-stranded ຊຸດກວດ DNA (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
ການວິເຄາະ MTS ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອວັດແທກການຂະຫຍາຍຕົວຂອງເຊນ.ຈຸລັງໄດ້ຖືກແກ່ນໃນແຜ່ນ 96 ຂຸມທີ່ມີຄວາມຫນາແຫນ້ນເບື້ອງຕົ້ນຂອງ 2000 ເຊນ/ດີ.ຈໍາ​ນວນ​ທີ່​ສົມ​ບູນ​ແບບ​ຂອງ​ຈຸ​ລັງ​ໄດ້​ຖືກ​ວັດ​ແທກ​ປະ​ຈໍາ​ວັນ​ໃນ​ເວ​ລາ​ທີ່​ກໍາ​ນົດ​ໄວ້​ສໍາ​ລັບ​ການ​ທັງ​ຫມົດ 4-6 ມື້​.ສໍາລັບແຕ່ລະດີ, 20 μlຂອງ MTS reagent (Promega) ໄດ້ຖືກເຈືອຈາງດ້ວຍ 100 μlຂອງ DMEM, incubated ກັບຈຸລັງສໍາລັບ 4 h ທີ່ 37 ° C, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນ OD490 ໄດ້ຖືກວັດແທກ.
ຄວາມອາດສາມາດສໍາລັບການຂະຫຍາຍຕົວທີ່ບໍ່ຕິດກັນໄດ້ຖືກຄົ້ນພົບໂດຍການວິເຄາະການສ້າງຕັ້ງຂອງ spheres.ໂດຍຫຍໍ້, 2000 ເຊລທີ່ຖືກຖ່າຍທອດດ້ວຍ shRNA DARS-AS1 ຫຼື shRNA ຄວບຄຸມໄດ້ຖືກປູກຝັງຢູ່ໃນຈຸນລະພາກທີ່ຕິດຄັດມາຕໍ່າສຸດ (Corning) ໂດຍມີການປ່ຽນແປງປານກາງທຸກໆ 4 ມື້.spheroids ໄດ້ຖືກນັບຫຼັງຈາກ 14 ມື້.500 ເຊລທີ່ຖືກຖ່າຍທອດດ້ວຍ DARS-AS1 plasmid overexpression plasmid ຫຼື plasmid ຄວບຄຸມໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການວິເຄາະການປັບປຸງ, ຖ້າບໍ່ດັ່ງນັ້ນວິທີການຈະບໍ່ປ່ຽນແປງ.
RNA ໄດ້ຖືກຖ່າຍທອດໂດຍໃຊ້ T7 RNA polymerase ແລະ biotin-16-UTP (Roche 1138908910) ຕາມຄໍາແນະນໍາຂອງ Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).primers ທີ່ໃຊ້ໃນທີ່ນີ້ແມ່ນໄດ້ລະບຸໄວ້ໃນຕາຕະລາງເສີມ 4.
ພາກພື້ນ PACT ຫຼື PKR ໂປຣຕີນໄດ້ຖືກໂຄນເຂົ້າໄປໃນ pET15b (Addgene #73619) ແລະປ່ຽນເປັນ BL21(DE3).ເຊື້ອແບັກທີເຣັຍໄດ້ຖືກອົບໃນຄືນໃນ LB ທີ່ສະຫນອງດ້ວຍ ampicillin ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນ diluted 100-fold ດ້ວຍ LB ສົດ.ເມື່ອ OD600 ຂອງຂະຫນາດກາງບັນລຸ 0.8, 1 mM IPTG ໄດ້ຖືກເພີ່ມເພື່ອກະຕຸ້ນການສະແດງອອກຂອງທາດໂປຼຕີນ.ຫຼັງ​ຈາກ​ການ​ຟອກ​ແລ້ວ​ຄືນ​ໜຶ່ງ​ດ້ວຍ​ການ​ສັ່ນ​ຢ່າງ​ອ່ອນ​ໂຍນ (250 rpm ທີ່ 20°C), ເມັດ​ເມັດ​ໄດ້​ຖືກ​ເກັບ​ເອົາ​ໂດຍ​ການ​ສູນ​ກາງ (4000 rpm, 10 min, 4°C).Resuspend cell pellet in lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) ແລະ incubate on ice for 30 min, then sonicate (15 min, 5 s on/off, on ice) ແລະ centrifuge (13,000. rpm)., 30 ນທ, 4°C).ຫຼັງຈາກນັ້ນ, supernatant ໄດ້ຖືກບັນຈຸໃສ່ Ni-NTA resin (QIAGEN) 3 ເທື່ອທີ່ 4 ° C, ລ້າງ 4 ເທື່ອດ້ວຍ wash buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) ແລະ eluted 3 ເທື່ອ, ທັງຫມົດ. ຂອງ 10 ml eluent buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazole).ທາດໂປຼຕີນທີ່ບໍລິສຸດຖືກກໍານົດໂດຍໃຊ້ WB ແລະຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນແມ່ນຖືກກໍານົດໂດຍໃຊ້ຊຸດທົດສອບທາດໂປຼຕີນຈາກ Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
ການວິເຄາະ RIP ໄດ້ຖືກປະຕິບັດຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນຫນ້ານີ້, ດ້ວຍການດັດແປງ.ໂດຍຫຍໍ້, 1x RIP buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) lyses 70 cytostatic cocktail (Roche, 1 mM DTT) ແລະ centrifuge ທີ່ 13,000 rpm ສໍາລັບ 15 ນາທີຢູ່ທີ່ 4 ° C.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, supernatant ໄດ້ຖືກ incubated ດ້ວຍທາດໂປຼຕີນ A+G magnetic beads (Millipore) conjugated ກັບ 5 μgຂອງ anti-PACT antibody (Abeam) ຫຼື IgG (CST).ລູກປັດໄດ້ຖືກລ້າງ 5 ເທື່ອດ້ວຍ 5x RIP buffer, ຫຼັງຈາກນັ້ນຖືກຍ່ອຍດ້ວຍທາດໂປຼຕີນຈາກ K (NEB).RNA ຖືກສະກັດດ້ວຍ Trizol ແລະກໍານົດໂດຍ RT-qPCR.Primers ໄດ້ຖືກນໍາສະເຫນີໃນຕາຕະລາງເສີມ 5.
ການທົດສອບ RIP ໃນ vitro ໄດ້ຖືກປະຕິບັດຕາມມາດຕະຖານການແກ້ໄຂ RIP assay protocol.ຈໍານວນທັງຫມົດຂອງ 5 pmol ຂອງ in vitro transcribed RNA ໄດ້ຖືກເຈືອຈາງ 1x ກັບ RIP buffer ແລະ annealed ໂດຍການ incubation ຢູ່ທີ່ 65 ° C ສໍາລັບ 5 ນາທີປະຕິບັດຕາມໂດຍການເຢັນຊ້າກັບອຸນຫະພູມຫ້ອງ.ທັງໝົດ 5 pmol ຂອງໂປຣຕີນ PACT ທີ່ຕິດປ້າຍທຸງທີ່ບໍ່ຄົງຕົວ ຫຼືປ່ຽນໄປໄດ້ຖືກຊໍາລະຈາກ E. coli.ອົບດ້ວຍ RNA ທົດແທນເປັນເວລາ 2 ຊົ່ວໂມງຢູ່ທີ່ 4 ° C ແລະປະຕິບັດຕາມຂັ້ນຕອນຂ້າງເທິງສໍາລັບການວິເຄາະ RIP ສໍາລັບ IP ຕ້ານທຸງ.
ສໍາລັບການວິເຄາະການຂະຫຍາຍ RNA, 1 × 107 ຈຸລັງໄດ້ຖືກ lysed ກັບ 1xRIP buffer.ຫຼັງ​ຈາກ​ສູນ​ກາງ​ທີ່ 13,000 rpm ເປັນ​ເວ​ລາ 15 ນາ​ທີ​ທີ່ 4 ° C, supernatant ໄດ້ pretreated ກັບ 30 μl​ຂອງ​ແມ່​ເຫຼັກ streptavidin (Beckman) ສໍາ​ລັບ 2 ຊົ່ວ​ໂມງ​ທີ່ 4 ° C.lysate ບໍລິສຸດໄດ້ຖືກສະຫນອງໃຫ້ກັບເຊື້ອລາ tRNA ແລະ incubated ກັບ 40 pmol ຂອງ RNA renatured ຄືນຄືນຢູ່ທີ່ 4 ° C, ຫຼັງຈາກນັ້ນສໍາລັບອີກ 2 ຊົ່ວໂມງແລະ 20 μlຂອງລູກປັດແມ່ເຫຼັກ streptavidin ໃຫມ່ສະກັດ BSA ໄດ້ຖືກເພີ່ມ.ຂັ້ນຕອນການລ້າງແມ່ນປະກອບດ້ວຍ 4 ຄັ້ງກັບ 5x RIP buffer ແລະ 4 ຄັ້ງກັບ 1x RIP buffer.ທາດໂປຼຕີນທີ່ສອດຄ້ອງກັນໄດ້ຖືກ eluted ກັບ biotin elution buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) ແລະແຍກຢູ່ໃນ NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).ຫຼັງຈາກ staining ເງິນ (Beyotime Biotechnology), ບາງແຖບໄດ້ຖືກ excised ແລະວິເຄາະໂດຍ MS.
ການວິເຄາະ Co-IP ໄດ້ຖືກປະຕິບັດເພື່ອທົດສອບການໂຕ້ຕອບລະຫວ່າງ PACT ແລະ PKR.ໂດຍຫຍໍ້, supernatant lysates ໄດ້ຖືກກະກຽມໂດຍການ incubating 1 x 107 ຈຸລັງ lysed ໃນ 1 x RIP buffer ປະຕິບັດຕາມດ້ວຍການ centrifugation ທີ່ 13,000 rpm ສໍາລັບ 15 ນາທີທີ່ 4 ° C.Lysates ໄດ້ຖືກບັນຈຸດ້ວຍລູກປັດສະນະແມ່ເຫຼັກຂອງທາດໂປຼຕີນ A + G, ສົມທົບກັບ 5 µg ຂອງ anti-PACT ແອນຕິບໍດີ, ແລະຄ່ອຍໆຫມຸນຄືນໃນຄືນທີ່ 4 ° C.ລູກປັດຖືກລ້າງ 3 ເທື່ອດ້ວຍ 5×RIP buffer, ສອງເທື່ອດ້ວຍ 1×RIP buffer ແລະ eluted ດ້ວຍ 1× SDS buffer.ທາດໂປຼຕີນທີ່ຟື້ນຕົວໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍ SDS-PAGE gel ແລະກວດພົບໂດຍ WB.
ສອງ pmol ຂອງ PACT ທຸງ ແລະ 1 pmol ຂອງ PKR ໄດ້ຖືກຊໍາລະຈາກ E. coli.ເຈືອຈາງໃນ 1 × RIP buffer ແລະ incubate ກັບ 10 pmol ຂອງ RNA renatured ສໍາລັບ 2 ຊົ່ວໂມງທີ່ 4 ° C.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ພວກມັນໄດ້ຖືກອົບດ້ວຍທາດໂປຼຕີນ A + G ຕ້ານການຕິດສະຫຼາກຂອງ antibody ທີ່ຕິດສະຫຼາກເປັນແມ່ເຫຼັກສໍາລັບສອງຊົ່ວໂມງ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ລູກປັດໄດ້ຖືກລ້າງສີ່ເທື່ອດ້ວຍ 1x RIP buffer ແລະ eluted ດ້ວຍ 1x SDS buffer.PACT ແລະ PKR ຜົນໄດ້ຮັບຖືກກວດພົບໂດຍ WB.