ຂ່າວ

ຂໍ​ຂອບ​ໃຈ​ທ່ານ​ສໍາ​ລັບ​ການ​ຢ້ຽມ​ຢາມ Nature.com​.ເວີຊັນຂອງຕົວທ່ອງເວັບທີ່ທ່ານກໍາລັງໃຊ້ມີການສະຫນັບສະຫນູນ CSS ຈໍາກັດ.ເພື່ອປະສົບການທີ່ດີທີ່ສຸດ, ພວກເຮົາແນະນຳໃຫ້ທ່ານໃຊ້ບຣາວເຊີທີ່ອັບເດດແລ້ວ (ຫຼືປິດການນຳໃຊ້ໂໝດຄວາມເຂົ້າກັນໄດ້ໃນ Internet Explorer).ໃນເວລານີ້, ເພື່ອຮັບປະກັນການສະຫນັບສະຫນູນຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ພວກເຮົາຈະສະແດງເວັບໄຊທ໌ໂດຍບໍ່ມີຮູບແບບແລະ JavaScript.
ວິທີການຕິດສະຫລາກຂອງ enzymatic proximity ໂດຍອີງໃສ່ esters ກະຕຸ້ນຫຼື phenoxy radicals ຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງໃນແຜນທີ່ subcellular proteomes ແລະທາດໂປຼຕີນ interactors ໃນຈຸລັງດໍາລົງຊີວິດ.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, esters activated ແມ່ນ reactive ຫນ້ອຍ, ເຮັດໃຫ້ radius ປ້າຍຊື່ກວ້າງ, ແລະ phenoxy radicals ທີ່ຜະລິດໂດຍການປິ່ນປົວ peroxide ສາມາດແຊກແຊງກັບ redox ເສັ້ນທາງ.ໃນທີ່ນີ້ພວກເຮົາລາຍງານວິທີການຕິດສະຫລາກທີ່ຕິດພັນກັບ photoactivation (PDPL) ທີ່ພັດທະນາໂດຍການເຊື່ອມໂຍງພັນທຸກໍາຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ miniSOG photosensitizer ກັບທາດໂປຼຕີນທີ່ມີຄວາມສົນໃຈ.ກະຕຸ້ນໂດຍແສງສະຫວ່າງສີຟ້າແລະຄວບຄຸມໂດຍເວລາການສໍາຜັດ, singlet ອົກຊີເຈນທີ່ຖືກສ້າງຂຶ້ນແລະຫຼັງຈາກນັ້ນການແກ້ໄຂການຕິດສະຫຼາກຂອງ histidine ຕົກຄ້າງໂດຍ aniline probe ແມ່ນບັນລຸໄດ້.ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມຊື່ສັດສູງຂອງມັນໂດຍຜ່ານການສ້າງແຜນທີ່ proteome ສະເພາະຂອງອະໄວຍະວະ.ການປຽບທຽບດ້ານຂ້າງຂອງ PDPL ກັບ TurboID ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງການຄຸ້ມຄອງ proteomic ທີ່ສະເພາະແລະຄົບຖ້ວນຂອງ PDPL.ຕໍ່ໄປ, ພວກເຮົາໄດ້ນຳໃຊ້ PDPL ໃຫ້ກັບຕົວກະຕຸ້ນການຖ່າຍທອດທີ່ຕິດພັນກັບພະຍາດ BRD4 ແລະ E3 Parkin ligase ແລະພົບເຫັນຕົວໂຕ້ຕອບທີ່ບໍ່ຮູ້ຈັກມາກ່ອນ.ໂດຍການກວດສອບ overexpression, ສອງ substrates ທີ່ບໍ່ຮູ້ຈັກ, Ssu72 ແລະ SNW1, ໄດ້ຖືກກໍານົດສໍາລັບ Parkin, ການເຊື່ອມໂຊມຂອງມັນແມ່ນ mediated ໂດຍເສັ້ນທາງ ubiquitination-proteasome.
ການກໍານົດລັກສະນະທີ່ຖືກຕ້ອງຂອງເຄືອຂ່າຍທາດໂປຼຕີນພາຍໃຕ້ຂະບວນການ cellular ພື້ນຖານຫຼາຍ.ດັ່ງນັ້ນ, ການສ້າງແຜນທີ່ spatiotemporal ທີ່ຖືກຕ້ອງສູງຂອງປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນຈະສະຫນອງພື້ນຖານໂມເລກຸນສໍາລັບ deciphering ເສັ້ນທາງຊີວະພາບ, pathology ຂອງພະຍາດ, ແລະການລົບກວນປະຕິສໍາພັນເຫຼົ່ານີ້ເພື່ອຈຸດປະສົງການປິ່ນປົວ.ເພື່ອເຮັດສິ່ງນີ້, ວິທີການທີ່ສາມາດກວດພົບການພົວພັນທາງໂລກໃນຈຸລັງຫຼືເນື້ອເຍື່ອທີ່ມີຊີວິດແມ່ນເປັນທີ່ຕ້ອງການຫຼາຍ.Affinity Purification Mass Spectrometry (AP-MS) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ໃນປະຫວັດສາດເພື່ອກໍານົດຄູ່ຮ່ວມງານຜູກມັດຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ມີຄວາມສົນໃຈ (POIs).ດ້ວຍການພັດທະນາວິທີການ proteomics ປະລິມານ, Bioplex3.0 ໄດ້ຖືກສ້າງຂື້ນ, ຖານຂໍ້ມູນທີ່ໃຫຍ່ທີ່ສຸດຂອງເຄືອຂ່າຍທາດໂປຼຕີນໂດຍອີງໃສ່ AP-MS.ເຖິງແມ່ນວ່າ AP-MS ແມ່ນມີອໍານາດຫຼາຍ, ຂັ້ນຕອນ lysis ຈຸລັງແລະການເຈືອຈາງໃນຂະບວນການເຮັດວຽກແມ່ນມີຄວາມລໍາອຽງໄປສູ່ການໂຕ້ຕອບການຜູກມັດທີ່ອ່ອນແອແລະຊົ່ວຄາວແລະແນະນໍາສິ່ງປະດິດຫລັງ lysis ເຊັ່ນ: ຄູ່ປະຕິສໍາພັນ spurious ທີ່ຂາດ compartmentalization ກ່ອນ lysis.
ເພື່ອແກ້ໄຂບັນຫາເຫຼົ່ານີ້, ອາຊິດ amino ທີ່ບໍ່ເປັນທໍາມະຊາດ (UAA) ກັບກຸ່ມເຊື່ອມຕໍ່ຂ້າມແລະແພລະຕະຟອມການຕິດສະຫລາກຂອງ enzymatic (PL) (ເຊັ່ນ: APEX ແລະ BioID)5 ໄດ້ຖືກພັດທະນາ.ເຖິງແມ່ນວ່າວິທີການ UAA ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງສໍາເລັດຜົນໃນຫຼາຍໆສະຖານະການແລະໃຫ້ຂໍ້ມູນກ່ຽວກັບການຍຶດຫມັ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນໂດຍກົງ, ການເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງສະຖານທີ່ແຊກ UAA ແມ່ນຍັງຕ້ອງການ.ສິ່ງທີ່ ສຳ ຄັນກວ່ານັ້ນ, ມັນແມ່ນວິທີການຕິດສະຫຼາກ stoichiometric ທີ່ຂາດການປີ້ນກັບກັນ catalytic ຂອງເຫດການການຕິດສະຫຼາກ.ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ວິທີການ PL enzymatic, ເຊັ່ນ: ວິທີການ BioID, fuse biotin ligase ວິສະວະກໍາກັບ POI7, ເຊິ່ງຕໍ່ມາກະຕຸ້ນ biotin ເພື່ອສ້າງເປັນ reactive biotinyl-AMP ester intermediate.ດັ່ງນັ້ນ, ເອນໄຊຈຶ່ງກະຕຸ້ນ ແລະປ່ອຍ biotin “ຟັງ” ທີ່ໃຊ້ແລ້ວທີ່ຕິດປ້າຍກຳກັບ lysine ທີ່ຢູ່ໃກ້ຄຽງ.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, BioID ຕ້ອງການຫຼາຍກວ່າ 12 ຊົ່ວໂມງເພື່ອໃຫ້ໄດ້ສັນຍານທີ່ຕິດສະຫຼາກຢ່າງພຽງພໍ, ເຊິ່ງກີດຂວາງການໃຊ້ຂອງມັນກັບການແກ້ໄຂຊົ່ວຄາວ.ການນໍາໃຊ້ວິວັຖນາການໂດຍກົງໂດຍອີງໃສ່ການສະແດງເຊື້ອລາ, TurboID ໄດ້ຖືກອອກແບບໂດຍອີງໃສ່ BioID ເພື່ອໃຫ້ມີປະສິດທິພາບຫຼາຍຂຶ້ນ, ຊ່ວຍໃຫ້ການຕິດສະຫຼາກທີ່ມີປະສິດຕິຜົນດ້ວຍ biotin ພາຍໃນ 10 ນາທີ, ອະນຸຍາດໃຫ້ມີການສຶກສາຂະບວນການເຄື່ອນໄຫວຫຼາຍຂຶ້ນ.ເນື່ອງຈາກວ່າ TurboID ມີການເຄື່ອນໄຫວສູງແລະລະດັບ biotin endogenous ແມ່ນພຽງພໍສໍາລັບການຕິດສະຫຼາກລະດັບຕ່ໍາ, ການຕິດສະຫຼາກພື້ນຫລັງກາຍເປັນບັນຫາທີ່ອາດຈະເກີດຂື້ນໃນເວລາທີ່ການຕິດສະຫຼາກທີ່ມີການປັບປຸງສູງແລະກໍານົດເວລາແມ່ນຕ້ອງການໂດຍການເພີ່ມ biotin exogenous.ນອກຈາກນັ້ນ, esters activated ແມ່ນ reactive ບໍ່ດີ (t1 / 2 ~ 5 min), ຊຶ່ງສາມາດນໍາໄປສູ່ radius ການຕິດສະຫຼາກຂະຫນາດໃຫຍ່, ໂດຍສະເພາະຫຼັງຈາກການອີ່ມຕົວຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ໃກ້ຄຽງກັບ biotin 5. ໃນວິທີການອື່ນ, fusion ພັນທຸ ກຳ ຂອງ ascorbate peroxidase (ie biotin- phenol radicals ແລະອະນຸຍາດໃຫ້ຕິດສະຫຼາກທາດໂປຼຕີນພາຍໃນຫນຶ່ງນາທີ 9,10. APEX ຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງເພື່ອກໍານົດ subcellular proteomes, ສະລັບສັບຊ້ອນທາດໂປຼຕີນຈາກເຍື່ອ, ແລະ cytosolic signaling protein complexes11,12. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ຄວາມຕ້ອງການຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ peroxides ສູງສາມາດສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ທາດໂປຼຕີນຈາກ redox ຫຼືເສັ້ນທາງ, disrupting. ຂະບວນການ cellular.
ດັ່ງນັ້ນ, ວິທີການໃຫມ່ທີ່ສາມາດສ້າງຊະນິດການສະກັດກັ້ນການຕິດສະຫລາກທີ່ມີ reactive ຫຼາຍທີ່ມີຄວາມຖືກຕ້ອງທາງກວ້າງຂອງພື້ນທີ່ແລະຊົ່ວຄາວໂດຍບໍ່ມີການລົບກວນເສັ້ນທາງໂທລະສັບມືຖືຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຈະເປັນສິ່ງທີ່ສໍາຄັນຕໍ່ກັບວິທີການທີ່ມີຢູ່. ໃນບັນດາຊະນິດທີ່ມີປະຕິກິລິຍາ, ອົກຊີແຊນດຽວໄດ້ກະຕຸ້ນຄວາມສົນໃຈຂອງພວກເຮົາເນື່ອງຈາກອາຍຸຂອງມັນສັ້ນແລະລັດສະຫມີການແຜ່ກະຈາຍຈໍາກັດ (t1/2 < 0.6 µs ໃນຈຸລັງ)13. ໃນບັນດາຊະນິດທີ່ມີປະຕິກິລິຍາ, ອົກຊີແຊນດຽວໄດ້ກະຕຸ້ນຄວາມສົນໃຈຂອງພວກເຮົາເນື່ອງຈາກອາຍຸຂອງມັນສັ້ນແລະລັດສະຫມີການແຜ່ກະຈາຍຈໍາກັດ (t1/2 < 0.6 µs ໃນຈຸລັງ)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени 1 дкени жизни и ограни и ограни ໃນ​ບັນ​ດາ​ຮູບ​ແບບ​ການ​ເຄື່ອນ​ໄຫວ, singlet oxygen ດຶງ​ດູດ​ຄວາມ​ສົນ​ໃຈ​ຂອງ​ພວກ​ເຮົາ​ເນື່ອງ​ຈາກ​ວ່າ​ມັນ​ມີ​ຊີ​ວິດ​ສັ້ນ​ແລະ radius ການ​ແຜ່​ກະ​ຈາຍ​ທີ່​ຈໍາ​ກັດ (t1/2 < 0.6 µs ໃນ​ຈຸ​ລັງ​)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs）而引起而引起 1/2 < 0.6 µs) 而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времанио дремени жизни и чанали ограна и чранограногранограна и среди. ໃນບັນດາຮູບແບບທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວ, singlet ອົກຊີເຈນດຶງດູດຄວາມສົນໃຈຂອງພວກເຮົາເນື່ອງຈາກອາຍຸຂອງມັນສັ້ນແລະລັດສະຫມີການແຜ່ກະຈາຍຈໍາກັດ (t1 / 2 < 0.6 μsໃນຈຸລັງ).ອົກຊີເຈນທີ່ Singlet ໄດ້ຖືກລາຍງານໂດຍສຸ່ມ oxidize methionine, tyrosine, histidine ແລະ tryptophan, ເຮັດໃຫ້ມັນເປັນຂົ້ວ 14,15 ສໍາລັບຕິດກັບ amine ຫຼື thiol ອີງໃສ່ probes16,17.ເຖິງແມ່ນວ່າອົກຊີເຈນທີ່ singlet ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອຕິດສະຫຼາກ RNA ຊ່ອງຍ່ອຍຂອງຈຸລັງຍ່ອຍ, ຍຸດທະສາດສໍາລັບ repurposing endogenous POI ເຄື່ອງຫມາຍຄວາມໃກ້ຊິດຍັງບໍ່ໄດ້ຮັບການຂຸດຄົ້ນ.ໃນທີ່ນີ້, ພວກເຮົານໍາສະເຫນີເວທີທີ່ເອີ້ນວ່າ photoactivation-dependent proximity labeling (PDPL), ບ່ອນທີ່ພວກເຮົາໃຊ້ແສງສີຟ້າເພື່ອເຮັດໃຫ້ມີແສງ POIs ປະສົມປະສານກັບ photosensitizer miniSOG ແລະກະຕຸ້ນການຜະລິດອົກຊີເຈນ singlet ເພື່ອ oxidize residues ໃກ້ຄຽງ, ປະຕິບັດຕາມໂດຍການດັດແກ້ທີ່ມີ amine ເພື່ອ oxidize probes ສານເຄມີເຂົ້າໄປໃນ. ຈຸລັງທີ່ມີຊີວິດລະດັບປານກາງ..ພວກ​ເຮົາ​ໄດ້​ທົດ​ສອບ​ກຸ່ມ​ຂອງ probes ສານ​ເຄ​ມີ​ເພື່ອ​ເພີ່ມ​ຄວາມ​ສະ​ເພາະ​ຂອງ​ໂຄດ​ຄໍາ​ສັ່ງ​ແລະ​ການ​ກໍາ​ນົດ​ສະ​ຖານ​ທີ່​ການ​ດັດ​ແກ້​ໂດຍ​ນໍາ​ໃຊ້​ຂະ​ບວນ​ການ proteomics ເປີດ​.ການປຽບທຽບດ້ານຂ້າງຂອງ PDPL ກັບ TurboID ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງການຄຸ້ມຄອງ proteomic ທີ່ສະເພາະແລະຄົບຖ້ວນຂອງ PDPL.ພວກເຮົາໄດ້ນໍາໃຊ້ວິທີການນີ້ກັບເຄື່ອງຫມາຍສະເພາະຂອງ organelle ຂອງ proteome subcellular ແລະການກໍານົດ proteome ທົ່ວໄປຂອງຄູ່ຮ່ວມງານຜູກມັດສໍາລັບທາດໂປຼຕີນຈາກ E3 ligase Parkin ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບມະເຮັງທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບພະຍາດ Parkinson ແລະ E3 ligase Parkin, ເຊິ່ງຢືນຢັນທັງສອງເຄືອຂ່າຍຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ຮູ້ຈັກແລະບໍ່ຮູ້ຈັກ. ການໂຕ້ຕອບ..ຄວາມສາມາດຂອງ PDPL ທີ່ຈະຮັບຮູ້ E3 substrates ໃນສະລັບສັບຊ້ອນທາດໂປຼຕີນຂະຫນາດໃຫຍ່ເປັນຕົວແທນຂອງສະຖານະການການຮັບຮູ້ຂອງ binders ທາງອ້ອມແມ່ນຕ້ອງການ.ສອງສານຍ່ອຍ Parkin ທີ່ບໍ່ຮູ້ຈັກທີ່ໄກ່ເກ່ຍໂດຍ ubiquitination-proteasome ໄດ້ຮັບການຢືນຢັນຢູ່ໃນສະຖານທີ່.
ການປິ່ນປົວດ້ວຍ Photodynamic (PDT)19 ແລະ chromophore-assisted laser inactivation (CALI)20, ເຊິ່ງການ irradiation ແສງສະຫວ່າງກັບ photosensitizers ສ້າງອົກຊີເຈນດຽວ, ສາມາດ inactivate ໂປຣຕີນເປົ້າຫມາຍຫຼືເຮັດໃຫ້ເກີດການເສຍຊີວິດຂອງເຊນ.ເນື່ອງຈາກອົກຊີເຈນ singlet ເປັນສານທີ່ມີປະຕິກິລິຍາສູງທີ່ມີໄລຍະການແຜ່ກະຈາຍທາງທິດສະດີປະມານ 70 nm, ການຜຸພັງທີ່ຈໍາກັດທາງພື້ນທີ່ປະມານ photosensitizer ສາມາດຄວບຄຸມໄດ້.ອີງໃສ່ແນວຄວາມຄິດນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ຕັດສິນໃຈໃຊ້ອົກຊີເຈນແບບ singlet ເພື່ອບັນລຸການຕິດສະຫລາກຢ່າງໃກ້ຊິດຂອງສະລັບສັບຊ້ອນທາດໂປຼຕີນໃນຈຸລັງທີ່ມີຊີວິດ.ພວກ​ເຮົາ​ໄດ້​ພັດ​ທະ​ນາ​ວິ​ທີ​ການ PDPL chemoproteomic ເພື່ອ​ປະ​ຕິ​ບັດ​ສີ່​ຫນ້າ​ທີ່​: (1​) ການ​ຜະ​ລິດ​ຂອງ​ອົກ​ຊີ​ເຈນ​ທີ່ singlet ມີ​ການ​ເຄື່ອນ​ໄຫວ​ຄ້າຍ​ຄື​ກັບ​ວິ​ທີ​ການ enzymatic PL​;(2) ສະໜອງການຕິດສະຫຼາກທີ່ແກ້ໄຂເວລາຕາມການລິເລີ່ມແສງສະຫວ່າງ;(3) ໂດຍການປ່ຽນແປງ (4) ຫຼີກເວັ້ນການນໍາໃຊ້ cofactors endogenous (ເຊັ່ນ: biotin) ເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນຄວາມເປັນມາ, ຫຼືນໍາໃຊ້ reagents exogenous ລົບກວນສູງ (ເຊັ່ນ peroxides) ເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນການສໍາຜັດກັບຈຸລັງກັບຄວາມກົດດັນສິ່ງແວດລ້ອມ.
Photosensitizers ສາມາດແບ່ງອອກເປັນສອງປະເພດລວມທັງ fluorophores ນ້ໍາຫນັກໂມເລກຸນຂະຫນາດນ້ອຍ (ເຊັ່ນ: rose bengal, methylene blue)22 ແລະທາດໂປຼຕີນຂະຫນາດນ້ອຍທີ່ຖືກເຂົ້າລະຫັດພັນທຸກໍາ (ເຊັ່ນ: miniSOG, KillerRed)23.ເພື່ອບັນລຸການອອກແບບ modular, ພວກເຮົາໄດ້ພັດທະນາແພລະຕະຟອມ PDPL ຮຸ່ນທໍາອິດໂດຍການເພີ່ມທາດໂປຼຕີນຈາກ photosensitizer (PS) ກັບ POI24,25 (ຮູບ 1a).ໃນເວລາທີ່ irradiated ກັບແສງສີຟ້າ, singlet ອົກຊີເຈນທີ່ oxidizes ທີ່ຢູ່ໃກ້ຄຽງ nucleophilic ອາຊິດ amino, ຜົນອອກມາໃນ polarity umpolung ທີ່ເປັນ electrophilic ແລະສາມາດ react ເພີ່ມເຕີມກັບ amine probe nucleophiles16,17.probe ໄດ້ຖືກອອກແບບດ້ວຍມືຈັບ alkyne ເພື່ອອະນຸຍາດໃຫ້ຄລິກເຄມີແລະດຶງລົງສໍາລັບການ LC / MS / MS characterization.
ຮູບແຕ້ມແບບແຜນຂອງການຕິດສະຫຼາກຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກສະລັບສັບຊ້ອນທີ່ໄກ່ເກ່ຍໂດຍ miniSOG.ເມື່ອຖືກແສງສີຟ້າ, ຈຸລັງທີ່ສະແດງ miniSOG-POI ຈະສ້າງອົກຊີເຈນແບບ singlet, ເຊິ່ງດັດແປງໂປຣຕີນທີ່ມີປະຕິກິລິຍາແຕ່ບໍ່ແມ່ນໂປຣຕີນທີ່ບໍ່ມີການຜູກມັດ.ຜະລິດຕະພັນລະດັບປານກາງຂອງ photooxidation ແມ່ນຖືກສະກັດໂດຍປ້າຍ relay ຂອງ probe ສານເຄມີ amine ເພື່ອສ້າງເປັນ adducts covalent.ກຸ່ມ alkynyl ໃນ probe ເຄມີອະນຸຍາດໃຫ້ຄລິກ chemistry ສໍາລັບ enrichment ໂດຍການດຶງລົງຕາມດ້ວຍ LC-MS / MS quantitation.b ໂຄງສ້າງທາງເຄມີຂອງ amine probes 1-4.c ການວິເຄາະ fluorescent gel ຕົວແທນຂອງ mitochondrial localized miniSOG-mediated proteomic markers ໂດຍໃຊ້ probes 1-4 ແລະປະລິມານທີ່ສົມທຽບໂດຍອີງໃສ່ gel densitometry.ອັດຕາສ່ວນສັນຍານກັບພື້ນຫຼັງຂອງ probes ສານເຄມີໄດ້ຖືກປະເມີນໂດຍໃຊ້ການທົດລອງການຄວບຄຸມທາງລົບບໍ່ລວມແສງສີຟ້າຫຼືການນໍາໃຊ້ຈຸລັງ HEK293T ໂດຍບໍ່ມີການສະແດງອອກ miniSOG.n = 2 ຕົວຢ່າງທີ່ເປັນເອກະລາດທາງຊີວະພາບ.ແຕ່ລະຈຸດສະແດງເຖິງການຈໍາລອງທາງຊີວະພາບ.d ການຊອກຄົ້ນຫາຕົວແທນແລະປະລິມານຂອງ PDPL ໂດຍໃຊ້ probe optimized 3 ໃນການສະແດງຫຼືບໍ່ມີອົງປະກອບ PDPL ທີ່ລະບຸເຊັ່ນ c.n = 3 ຕົວຢ່າງທີ່ເປັນເອກະລາດທາງຊີວະພາບ.ແຕ່ລະຈຸດສະແດງເຖິງການຈໍາລອງທາງຊີວະພາບ.ເສັ້ນກາງ ແລະ ມົດລູກ ເປັນຕົວແທນຂອງຄ່າສະເລ່ຍ ແລະ ±ການບ່ຽງເບນມາດຕະຖານ.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e ການຖ່າຍຮູບແບບ Confocal ຂອງອົກຊີເຈນດຽວທີ່ມີຮອຍເປື້ອນ Si-DMA ສີແດງ.ແຖບຂະຫນາດ: 10 µm.ການທົດລອງການຖ່າຍຮູບເຈວ ແລະ ໂຟກັສຖືກເຮັດຊ້ຳຢ່າງເປັນອິດສະຫຼະຢ່າງໜ້ອຍສອງຄັ້ງດ້ວຍຜົນໄດ້ຮັບທີ່ຄ້າຍຄືກັນ.
ພວກເຮົາທໍາອິດໄດ້ທົດສອບຄວາມສາມາດຂອງເຄື່ອງຖ່າຍພາບທີ່ແກ່ແລ້ວ miniSOG26 ແລະ KillerRed23, ສະແດງອອກຢ່າງໝັ້ນທ່ຽງໃນ HEK293T, ເພື່ອໄກ່ເກ່ຍການຕິດສະຫຼາກຂອງ propargylamine ຂອງ proteome ເປັນການສືບສວນທາງເຄມີ (ຮູບພາບເສີມ 1a).ການວິເຄາະ fluorescence gel ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການຕິດສະຫລາກ proteome ທັງຫມົດແມ່ນບັນລຸໄດ້ໂດຍໃຊ້ miniSOG ແລະການ irradiation ແສງສະຫວ່າງສີຟ້າ, ໃນຂະນະທີ່ບໍ່ມີຜະລິດຕະພັນການຕິດສະຫຼາກທີ່ສັງເກດເຫັນໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນດ້ວຍ KillerRed.ເພື່ອປັບປຸງອັດຕາສ່ວນສັນຍານກັບພື້ນຫລັງ, ພວກເຮົາໄດ້ທົດສອບຊຸດຂອງ probes ສານເຄມີທີ່ປະກອບດ້ວຍ aniline (1 ແລະ 3), propylamine (2), ຫຼື benzylamine (4).ພວກ​ເຮົາ​ໄດ້​ສັງ​ເກດ​ເຫັນ​ວ່າ​ເຊ​ລ HEK293T ດ້ວຍ​ຕົວ​ມັນ​ເອງ​ມີ​ສັນ​ຍານ​ພື້ນ​ຖານ​ທີ່​ສູງ​ກວ່າ​ເມື່ອ​ທຽບ​ໃສ່​ກັບ​ບໍ່​ມີ​ແສງ​ສີ​ຟ້າ, ເປັນ​ໄປ​ໄດ້​ເນື່ອງ​ຈາກ​ການ endogenous riboflavin photosensitizer, flavin mononucleotide (FMN) 27 . probes ສານເຄມີທີ່ອີງໃສ່ Aniline 1 ແລະ 3 ໃຫ້ຄວາມສະເພາະທີ່ດີກວ່າ, ໂດຍ HEK293T ສະແດງອອກຢ່າງຫມັ້ນຄົງ miniSOG ໃນ mitochondria ສະແດງສັນຍານເພີ່ມຂຶ້ນ 8 ເທົ່າສໍາລັບ probe 3, ໃນຂະນະທີ່ probe 2 ໃຊ້ໃນວິທີການຕິດປ້າຍ RNA CAP-seq ພຽງແຕ່ສະແດງ ~ 2.5- fold signal ເພີ່ມຂຶ້ນ, ອາດຈະເປັນຍ້ອນຄວາມມັກຂອງ reactivity ທີ່ແຕກຕ່າງກັນລະຫວ່າງ RNA ແລະທາດໂປຼຕີນ (ຮູບ 1b, c). probes ສານເຄມີທີ່ອີງໃສ່ Aniline 1 ແລະ 3 ໃຫ້ຄວາມສະເພາະທີ່ດີກວ່າ, ໂດຍ HEK293T ສະແດງອອກຢ່າງຫມັ້ນຄົງ miniSOG ໃນ mitochondria ສະແດງສັນຍານເພີ່ມຂຶ້ນ 8 ເທົ່າສໍາລັບ probe 3, ໃນຂະນະທີ່ probe 2 ໃຊ້ໃນວິທີການຕິດປ້າຍ RNA CAP-seq ພຽງແຕ່ສະແດງ ~ 2.5- fold signal ເພີ່ມຂຶ້ນ, ອາດຈະເປັນຍ້ອນຄວາມມັກຂອງ reactivity ທີ່ແຕກຕ່າງກັນລະຫວ່າງ RNA ແລະທາດໂປຼຕີນ (ຮູບ 1b, c).probes ສານເຄມີທີ່ອີງໃສ່ Aniline 1 ແລະ 3 ສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມສະເພາະທີ່ດີກວ່າ: HEK293T, ເຊິ່ງສະແດງເຖິງຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງ miniSOG ໃນ mitochondria, ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງການເພີ່ມຂຶ້ນ 8 ເທົ່າຂອງສັນຍານສໍາລັບ probe 3, ໃນຂະນະທີ່ probe 2, ຖືກນໍາໃຊ້ໃນວິທີການຕິດສະຫຼາກ CAP-seq RNA, ເທົ່ານັ້ນ. ສະແດງໃຫ້ເຫັນສັນຍານເພີ່ມຂຶ້ນ 2.5 ເທົ່າ, ອາດຈະເປັນຍ້ອນຄວາມມັກຂອງປະຕິກິລິຍາທີ່ແຕກຕ່າງກັນລະຫວ່າງ RNA ແລະທາດໂປຼຕີນ (ຮູບ 1b, c).基于苯胺苯胺苯胺的 1 和具有具有具有好特异性在线线线表达 minisog, 而方法方法方法 rna 标记方法 cap-seq 的方法 cap-seq 的探针 cap-seq 的探针 2 仅仅仅 2 仅仅仅仅 2 仅仅仅2.5-倍信号增加，可能是由于RNA和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c).基于苯胺苯胺苯胺 1 和具有具有具有的特异性在粒体粒体表达表达粒体粒体而而倍 rna 标记 rna 标记 rna 标记 Cap-Eq 的 2 仅的 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNAprobes ສານເຄມີທີ່ອີງໃສ່ Aniline 1 ແລະ 3 ມີຄວາມສະເພາະທີ່ດີກວ່າ, HEK293T ສະແດງອອກຢ່າງຫມັ້ນຄົງ miniSOG ໃນ mitochondria, ແລະ probe 3 ມີສັນຍານເພີ່ມຂຶ້ນຫຼາຍກວ່າ 8 ເທົ່າ, ໃນຂະນະທີ່ probe 2 ສໍາລັບວິທີການຕິດສະຫຼາກ CAP-seq RNA ສະແດງໃຫ້ເຫັນພຽງແຕ່ ~ 2.5 - ເພີ່ມຂຶ້ນ.ໃນສັນຍານ, ອາດຈະເປັນຍ້ອນຄວາມມັກຂອງຕິກິຣິຍາທີ່ແຕກຕ່າງກັນລະຫວ່າງ RNA ແລະທາດໂປຼຕີນ (ຮູບ 1b, c).ນອກຈາກນັ້ນ, probe 3 isomers ແລະ hydrazine probes (probes 5, 6, 7) ໄດ້ຖືກທົດສອບ, ຢືນຢັນການເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງ probe 3 (Supplementary Fig. 1b,c).ເຊັ່ນດຽວກັນ, ການວິເຄາະ fluorescence in-gel ໄດ້ເປີດເຜີຍຕົວກໍານົດການທົດລອງທີ່ດີທີ່ສຸດອື່ນໆ: ຄວາມຍາວຄື້ນການ irradiation (460 nm), ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ probe ສານເຄມີ (1 mM), ແລະ irradiation time (20 min) (ເພີ່ມເຕີມ Fig. 2a–c).ການລະເວັ້ນອົງປະກອບ ຫຼືຂັ້ນຕອນໃດນຶ່ງໃນອະນຸສັນຍາ PDPL ສົ່ງຜົນໃຫ້ເກີດການປ່ຽນສັນຍານອັນສຳຄັນກັບພື້ນຫຼັງ (ຮູບ 1d).ໂດຍສະເພາະ, ການຕິດສະຫຼາກທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນປະກົດຕົວຂອງ sodium azide ຫຼື trolox, ເຊິ່ງເປັນທີ່ຮູ້ຈັກທີ່ຈະດັບອົກຊີເຈນທີ່ singlet.ການປະກົດຕົວຂອງ D2O, ເຊິ່ງເປັນທີ່ຮູ້ຈັກເພື່ອສະຖຽນລະພາບອົກຊີເຈນທີ່ singlet, ເສີມຂະຫຍາຍສັນຍານການຕິດສະຫຼາກ.ເພື່ອສືບສວນການປະກອບສ່ວນຂອງຊະນິດອົກຊີເຈນທີ່ມີປະຕິກິລິຍາອື່ນໆໃນການຕິດສະຫຼາກ, mannitol ແລະວິຕາມິນ C ໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໃນການສ້າງຕັ້ງສານສະກັດຈາກຮາກ hydroxyl ແລະ superoxide ຕາມລໍາດັບ, 18, 29, ແຕ່ພວກມັນບໍ່ພົບວ່າການຫຼຸດຜ່ອນການຕິດສະຫຼາກ.ການເພີ່ມ H2O2, ແຕ່ບໍ່ເຮັດໃຫ້ມີແສງ, ບໍ່ມີຜົນໃນການຕິດສະຫຼາກ (ຕື່ມ Fig. 3a).ການຖ່າຍຮູບອົກຊີເຈນແບບດ່ຽວ fluorescence ດ້ວຍເຄື່ອງສຳຫຼວດ Si-DMA ໄດ້ຢືນຢັນການປະກົດຕົວຂອງອົກຊີເຈນດ່ຽວໃນສາຍ HEK293T-miniSOG, ແຕ່ບໍ່ແມ່ນຢູ່ໃນສາຍ HEK293T ເດີມ.ນອກຈາກນັ້ນ, mitoSOX Red ບໍ່ສາມາດກວດພົບການຜະລິດ superoxide ຫຼັງຈາກ illumination (ຮູບ 1e ແລະເສີມ Fig. 3b) 30. ຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນຢ່າງແຂງແຮງວ່າອົກຊີເຈນ singlet ແມ່ນຊະນິດອົກຊີເຈນທີ່ມີປະຕິກິລິຍາຕົ້ນຕໍທີ່ຮັບຜິດຊອບສໍາລັບການຕິດສະຫຼາກ proteomic ຕໍ່ມາ.Cytotoxicity ຂອງ PDPL ໄດ້ຖືກປະເມີນລວມທັງການ irradiation ແສງສະຫວ່າງສີຟ້າແລະ probes ສານເຄມີ, ແລະບໍ່ມີການສັງເກດເຫັນ cytotoxicity ທີ່ສໍາຄັນ (ຮູບເພີ່ມເຕີມ 4a).
ເພື່ອສຶກສາກົນໄກການຕິດສະຫຼາກແລະເປີດໃຊ້ການກໍານົດ proteomic ຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກສະລັບສັບຊ້ອນໂດຍໃຊ້ LC-MS / MS, ທໍາອິດພວກເຮົາຈໍາເປັນຕ້ອງໄດ້ກໍານົດວ່າອາຊິດ amino ທີ່ຖືກດັດແປງແລະມະຫາຊົນ delta ຂອງປ້າຍ probe.Methionine, histidine, tryptophan ແລະ tyrosine ໄດ້ຖືກລາຍງານວ່າຖືກດັດແປງໂດຍ singlet oxygen14,15.ພວກເຮົາປະສົມປະສານຂະບວນການເຮັດວຽກຂອງ TOP-ABPP31 ກັບການຄົ້ນຫາແບບເປີດທີ່ບໍ່ລໍາອຽງທີ່ສະຫນອງໂດຍເວທີຄອມພິວເຕີ້ FragPipe ໂດຍອີງໃສ່ MSFragger32.ຫຼັງຈາກການດັດແກ້ອົກຊີເຈນທີ່ singlet ແລະການຕິດສະຫຼາກ probe ສານເຄມີ, ເຄມີສາດຄລິກໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ປ້າຍການຫຼຸດຜ່ອນ biotin ທີ່ມີຕົວເຊື່ອມຕໍ່ cleavable, ຕິດຕາມດ້ວຍ neutravidin stretching ແລະການຍ່ອຍອາຫານ trypsin.peptide ທີ່ຖືກດັດແປງ, ຍັງຜູກມັດກັບຢາງ, ໄດ້ຖືກ photocleaved ສໍາລັບການວິເຄາະ LC-MS / MS (ຮູບ 2a ແລະຂໍ້ມູນເສີມ 1).ຈໍານວນຂະຫນາດໃຫຍ່ຂອງການດັດແປງເກີດຂຶ້ນໃນທົ່ວ proteome ທີ່ມີຫຼາຍກວ່າ 50 peptide ແຜນທີ່ (PSM) ກົງກັນໃນລາຍການ (ຮູບ 2b).ເປັນເລື່ອງແປກທີ່, ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນພຽງແຕ່ການດັດແກ້ຂອງ histidine, ອາດຈະເປັນຍ້ອນປະຕິກິລິຍາທີ່ສູງຂຶ້ນຂອງ histidine oxidized ຕໍ່ກັບ probes aniline ກ່ວາອາຊິດ amino ອື່ນໆ.ອີງຕາມກົນໄກການຈັດພີມມາ histidine oxidation ໂດຍ singlet ອົກຊີ, 21,33 ສະເຫນີໂຄງສ້າງ delta-mass ຂອງ +229 Da ກົງກັບ adduct ຂອງ probe 3 ກັບ 2-oxo-histidine ຫຼັງຈາກການຜຸພັງສອງ, ໃນຂະນະທີ່ +247 Da ແມ່ນຜະລິດຕະພັນ hydrolysis. ຂອງ +229 Da (ຕື່ມ Fig. 5).ການປະເມີນຜົນຂອງ MS2 spectrum ສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມຫນ້າເຊື່ອຖືສູງຂອງການກໍານົດສ່ວນໃຫຍ່ຂອງ y ແລະ b ions, ລວມທັງການກໍານົດຂອງ ions fragment ທີ່ຖືກດັດແປງ (y ແລະ b) (ຮູບ 2c).ການວິເຄາະບໍລິບົດຂອງລຳດັບທ້ອງຖິ່ນຂອງ histidines ທີ່ຖືກດັດແປງ PDPL ເປີດເຜີຍຄວາມມັກຂອງ motif ປານກາງສຳລັບສານຕົກຄ້າງ hydrophobic ຂະໜາດນ້ອຍຢູ່ທີ່ ±1 ຕຳແໜ່ງ (ຮູບປະກອບ 4b).ໂດຍສະເລ່ຍ, 1.4 histidines ໄດ້ຖືກກໍານົດຕໍ່ທາດໂປຼຕີນ, ແລະສະຖານທີ່ຂອງເຄື່ອງຫມາຍເຫຼົ່ານີ້ຖືກກໍານົດໂດຍພື້ນທີ່ຂອງສານລະລາຍທີ່ສາມາດເຂົ້າເຖິງໄດ້ (SASA) ແລະການວິເຄາະຄວາມພ້ອມຂອງສານລະລາຍທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ (RSA) (ຕື່ມ Fig. 4c,d).
ຂັ້ນຕອນການເຮັດວຽກທີ່ບໍ່ມີອະຄະຕິສໍາລັບການສຶກສາການຄັດເລືອກທີ່ເຫຼືອໂດຍໃຊ້ແພລະຕະຟອມຄອມພິວເຕີ້ FragPipe ຂັບເຄື່ອນໂດຍ MSFragger.ການເຊື່ອມຕໍ່ Cleavable ຖືກນໍາໃຊ້ໃນ Click chemistry ເພື່ອອະນຸຍາດໃຫ້ photocleavage ຂອງ peptides ດັດແກ້ຈາກ streptavidin resin.ການຄົ້ນຫາແບບເປີດໄດ້ຖືກເປີດຕົວເພື່ອກໍານົດການດັດແກ້ຈໍານວນຫລາຍ, ເຊັ່ນດຽວກັນກັບສິ່ງທີ່ເຫຼືອທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ.b ກໍານົດມະຫາຊົນຂອງການດັດແປງທີ່ເກີດຂຶ້ນໃນທົ່ວ proteome.ການສ້າງແຜນທີ່ Peptide PSM.c MS2 spectral annotation ຂອງສະຖານທີ່ histidine ດັດແກ້ກັບ probe 3. ເປັນຕົວຢ່າງຕົວແທນ, ປະຕິກິລິຍາ covalent ກັບ probe 3 ເພີ່ມ +229.0938 Da ກັບອາຊິດ amino ດັດແກ້.d ການວິເຄາະການກາຍພັນທີ່ໃຊ້ໃນການທົດສອບສໍາລັບເຄື່ອງຫມາຍ PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) ແລະ PRDX1 (H10A, H81A, H169A) ຖືກຖ່າຍທອດດ້ວຍ plasmids ປະເພດປ່າເພື່ອກວດຫາການຕ້ານທຸງ.e peptide ສັງເຄາະໄດ້ຖືກປະຕິກິລິຍາກັບ miniSOG ບໍລິສຸດຢູ່ໃນທີ່ປະທັບຂອງ probe 3 ແລະຜະລິດຕະພັນທີ່ສອດຄ້ອງກັນກັບ Δm +247 ແລະ +229 ໄດ້ຖືກບັນທຶກໄວ້ໃນສະເປກ LC-MS.f ປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນກັບທາດໂປຼຕີນໃນ vitro ໄດ້ແບບຈໍາລອງກັບ miniSOG-6xHis-tag ແລະ anti-6xHis antibody.Antibiotin (streptavidin-HRP) ແລະການວິເຄາະ blot ຕາເວັນຕົກຂອງ anti-mouse ຂອງ antibody complexes miniSOG-6xHis/anti-6xHis ທີ່ຕິດປ້າຍກັບ probe 3, ຂຶ້ນກັບເວລາຂອງການໄດ້ຮັບແສງສະຫວ່າງ.ປ້າຍຊື່ສໍາລັບທາດໂປຼຕີນສ່ວນບຸກຄົນແມ່ນສະແດງອອກໃນນ້ໍາຫນັກໂມເລກຸນທີ່ສອດຄ້ອງກັນ: LC antibody light chain, HC antibody heavy chain.ການທົດລອງເຫຼົ່ານີ້ຖືກເຮັດຊ້ຳຢ່າງເປັນອິດສະຫຼະຢ່າງໜ້ອຍສອງຄັ້ງດ້ວຍຜົນໄດ້ຮັບທີ່ຄ້າຍຄືກັນ.
ສໍາລັບການກວດສອບທາງຊີວະເຄມີຂອງສະຖານທີ່ຕິດສະຫຼາກ, PRDX3 ແລະ PRDX1 ທີ່ຖືກກໍານົດໂດຍ spectrometry ມະຫາຊົນໄດ້ຖືກປ່ຽນຈາກ histidine ເປັນ alanine ແລະປຽບທຽບກັບປະເພດທໍາມະຊາດໃນການວິເຄາະການຖ່າຍທອດ.ຜົນໄດ້ຮັບຂອງ PDPL ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການກາຍພັນຫຼຸດລົງການຕິດສະຫລາກຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (ຮູບ 2d).ໃນຂະນະດຽວກັນ, ລໍາດັບ peptide ທີ່ໄດ້ລະບຸໄວ້ໃນການຄົ້ນຫາແບບເປີດໄດ້ຖືກສັງເຄາະແລະປະຕິກິລິຍາໃນ vitro ກັບ miniSOG ບໍລິສຸດຢູ່ໃນທີ່ປະທັບຂອງ probe 3 ແລະແສງສະຫວ່າງສີຟ້າ, ຜົນຜະລິດຜະລິດຕະພັນທີ່ມີການປ່ຽນແປງມະຫາຊົນຂອງ +247 ແລະ +229 Da ເມື່ອກວດພົບໂດຍ LC-MS (ຮູບ. .2e).).ເພື່ອທົດສອບວ່າທາດໂປຼຕີນທີ່ມີປະຕິສໍາພັນສາມາດຖືກຕິດສະຫຼາກໃນ vitro ເພື່ອຕອບສະຫນອງຕໍ່ການກະຕຸ້ນການຖ່າຍຮູບ miniSOG, ພວກເຮົາໄດ້ອອກແບບການທົດສອບຄວາມໃກ້ຄຽງປອມໂດຍການປະຕິສໍາພັນລະຫວ່າງທາດໂປຼຕີນຈາກ miniSOG-6xHis ແລະ anti-His monoclonal antibody in vitro (ຮູບ 2f).ໃນການວິເຄາະນີ້, ພວກເຮົາຄາດວ່າການຕິດສະຫຼາກໃກ້ໆກັນຂອງສາຍຕ່ອງໂສ້ທີ່ໜັກ ແລະ ເບົາຂອງພູມຕ້ານທານກັບ miniSOG.ໃນຄວາມເປັນຈິງ, ຕ້ານຫນູ (ຮັບຮູ້ລະບົບຕ່ອງໂສ້ຫນັກແລະເບົາຂອງ anti-6xHis-labeled antibody) ແລະ streptavidin Western blots ສະແດງໃຫ້ເຫັນ biotinylation ທີ່ເຂັ້ມແຂງຂອງຕ່ອງໂສ້ຫນັກແລະເບົາ.ໂດຍສະເພາະ, ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນ miniSOG autobiotinylation ເນື່ອງຈາກແທັກ 6xHis ແລະການເຊື່ອມຕໍ່ຂ້າມລະຫວ່າງສາຍຕ່ອງໂສ້ເບົາແລະຫນັກ, ເຊິ່ງອາດຈະກ່ຽວຂ້ອງກັບຊ່ອງຫວ່າງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍກ່ອນຫນ້ານີ້ລະຫວ່າງ lysine ແລະ 2-oxo-histidine proximal response.ສະຫຼຸບແລ້ວ, ພວກເຮົາສະຫຼຸບວ່າ PDPL ດັດແປງ histidine ໃນລັກສະນະໃກ້ຄຽງ.
ເປົ້າຫມາຍຕໍ່ໄປຂອງພວກເຮົາແມ່ນເພື່ອກໍານົດລັກສະນະ subcellular proteome ເພື່ອທົດສອບສະເພາະຂອງການຕິດສະຫຼາກໃນ siteu.ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາສະແດງອອກຢ່າງຫມັ້ນຄົງ miniSOG ໃນ nucleus, mitochondrial matrix, ຫຼືເຍື່ອ ER ຊັ້ນນອກຂອງຈຸລັງ HEK293T (ຮູບ 3a).ການວິເຄາະ fluorescence gel ໄດ້ເປີດເຜີຍແຖບຕິດສະຫຼາກທີ່ອຸດົມສົມບູນຢູ່ໃນສາມສະຖານທີ່ຍ່ອຍເຊັ່ນດຽວກັນກັບຮູບແບບການຕິດສະຫຼາກທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (ຮູບ 3b).ການວິເຄາະຮູບພາບ fluorescence ສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມສະເພາະສູງຂອງ PDPL (ຮູບ 3c).ຂະບວນການເຮັດວຽກຂອງ PDPL ແມ່ນປະຕິບັດຕາມປະຕິກິລິຍາຄລິກກັບສີຍ້ອມ rhodamine ເພື່ອ delineate subcellular proteomes ໂດຍໃຊ້ກ້ອງຈຸລະທັດ fluorescence, ແລະສັນຍານ PDPL ໄດ້ຖືກປະສົມກັບ DAPI, ຕົວຕິດຕາມ mitochondrial, ຫຼື ER trackers, ຢືນຢັນຄວາມຊື່ສັດສູງຂອງ PDPL.ສໍາລັບສາມສະຖານທີ່ organelle, ການປຽບທຽບຂ້າງຄຽງຂອງ PDPL ກັບ TurboID ໂດຍໃຊ້ avidin western blot ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ PDPL ໄດ້ຖືກຕິດສະຫຼາກໂດຍສະເພາະເມື່ອທຽບກັບການຄວບຄຸມຂອງພວກເຂົາ.ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂ PDPL, ແຖບທີ່ຕິດສະຫຼາກຫຼາຍປະກົດຂຶ້ນ, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງໂປຣຕີນທີ່ມີປ້າຍກຳກັບ PDPL ຫຼາຍຂຶ້ນ (ຮູບພາບເສີມ 6a-d).
ການສະແດງແບບແຜນຂອງການຕິດສະຫຼາກ proteome ສະເພາະຂອງ organelle-mediated miniSOG.miniSOG ແນເປົ້າໃສ່ mitochondrial matrix ຜ່ານ fusion ກັບ N-terminal 23 ອາຊິດ amino ຂອງ COX4 ຂອງມະນຸດ (mito-miniSOG), ນິວເຄລຍໂດຍຜ່ານ fusion ກັບ H2B (nucleus-miniSOG), ແລະ Sec61βຜ່ານ cytoplasmic ຂ້າງຂອງເຍື່ອ ER (ER-miniSOG. ).ຕົວຊີ້ບອກປະກອບມີການຖ່າຍຮູບເຈວ, ການຖ່າຍຮູບແບບ confocal, ແລະ spectrometry ມະຫາຊົນ.b ຮູບພາບ gel ຕົວແທນຂອງສາມ organelle-specific PDPL ໂປຣໄຟລ໌.CBB Coomassie Brilliant Blue.c ຕົວແທນຮູບພາບ confocal ຂອງຈຸລັງ HEK293T ສະແດງອອກຢ່າງຫມັ້ນຄົງ miniSOG ກັບ subcellular localizations ທີ່ແຕກຕ່າງກັນກວດພົບໂດຍ antibody ຕິດປ້າຍ V5 (ສີແດງ).ເຄື່ອງຫມາຍ subcellular ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບ mitochondria ແລະ ER (ສີຂຽວ).ຂະບວນການເຮັດວຽກຂອງ PDPL ປະກອບມີການກວດຫາ miniSOG (ສີເຫຼືອງ) proteomes subcellular ທີ່ມີປ້າຍຊື່ໂດຍໃຊ້ Cy3-azide click chemistry.ແຖບຂະຫນາດ: 10 µm.d ພື້ນທີ່ພູເຂົາໄຟຂອງ PDPL-tagged proteomes ໃນ organelles ຕ່າງໆ quantified by unlabeled quantification (n = 3 ການທົດລອງທາງຊີວະພາບເອກະລາດ).ການທົດສອບ t ຂອງນັກຮຽນສອງຫາງໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ໃນພື້ນທີ່ຂອງພູເຂົາໄຟ.ປະເພດປ່າທໍາມະຊາດ HEK293T ຖືກໃຊ້ເປັນການຄວບຄຸມທາງລົບ. ໂປຣຕີນທີ່ມີການປ່ຽນແປງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍແມ່ນເນັ້ນໃສ່ເປັນສີແດງ (p < 0.05 ແລະ > ຄວາມແຕກຕ່າງຄວາມເຂັ້ມຂອງທາດໄອອອນ 2 ເທົ່າ). ໂປຣຕີນທີ່ມີການປ່ຽນແປງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍແມ່ນເນັ້ນໃສ່ເປັນສີແດງ (p < 0.05 ແລະ > ຄວາມແຕກຕ່າງຄວາມເຂັ້ມຂອງທາດໄອອອນ 2 ເທົ່າ). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 ແລະ >2-кратная разница в интенсивиност). ໂປຣຕີນທີ່ມີການປ່ຽນແປງຢ່າງມີໄນສໍາຄັນແມ່ນເນັ້ນໃສ່ເປັນສີແດງ (p < 0.05 ແລະ > ຄວາມແຕກຕ່າງຂອງຄວາມເຂັ້ມຂອງທາດໄອອອນ 2 ເທົ່າ).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 ແລະ > 2-кратная разница в ионной силе). ທາດໂປຼຕີນທີ່ມີການປ່ຽນແປງຢ່າງມີໄນສໍາຄັນແມ່ນເນັ້ນໃສ່ເປັນສີແດງ (p < 0.05 ແລະ > ຄວາມແຕກຕ່າງ 2 ເທົ່າຂອງຄວາມເຂັ້ມແຂງ ionic).ໂປຣຕີນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງທີ່ສໍາຄັນສໍາລັບ HEK293T-miniSOG ແຕ່ບໍ່ສໍາຄັນສໍາລັບ HEK293T ແມ່ນສະແດງເປັນສີຂຽວ.e ການວິເຄາະຄວາມສະເພາະຂອງຊຸດຂໍ້ມູນ proteomic ຈາກການທົດລອງ d.ຈໍາ​ນວນ​ທັງ​ຫມົດ​ຂອງ​ທາດ​ໂປຼ​ຕີນ​ທີ່​ສໍາ​ຄັນ​ທາງ​ສະ​ຖິ​ຕິ​ໃນ​ແຕ່​ລະ organelle (ຈຸດ​ສີ​ແດງ​ແລະ​ສີ​ຂຽວ​) ແມ່ນ​ຫມາຍ​ຢູ່​ເທິງ​.Histograms ສະແດງໃຫ້ເຫັນທາດໂປຼຕີນທີ່ທ້ອງຖິ່ນຢູ່ໃນ organelles ໂດຍອີງໃສ່ MitoCarta 3.0, ການວິເຄາະ GO ແລະ A. Ting et al.ຄົນ.ຊຸດຂໍ້ມູນແຍກຕ່າງຫາກສໍາລັບ mitochondria, nuclei, ແລະ ER.ການທົດລອງເຫຼົ່ານີ້ຖືກເຮັດຊ້ຳຢ່າງເປັນອິດສະຫຼະຢ່າງໜ້ອຍສອງຄັ້ງດ້ວຍຜົນໄດ້ຮັບທີ່ຄ້າຍຄືກັນ.ຂໍ້ມູນດິບແມ່ນສະຫນອງໃຫ້ໃນຮູບແບບຂອງໄຟລ໌ຂໍ້ມູນດິບ.
ໄດ້ຮັບການຊຸກຍູ້ຈາກ gel ແລະຜົນໄດ້ຮັບການຖ່າຍຮູບ, ປະລິມານທີ່ບໍ່ມີປ້າຍຊື່ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກໍານົດປະລິມານຂອງ proteome ທີ່ກໍານົດໃນແຕ່ລະ organelle (ຂໍ້ມູນເສີມ 2).Untransfected HEK293T ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນການຄວບຄຸມທາງລົບເພື່ອລົບເຄື່ອງຫມາຍພື້ນຫລັງ. ການວິເຄາະແຜນຜັງພູເຂົາໄຟໄດ້ສະແດງໂປຣຕີນທີ່ອຸດົມສົມບູນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (p <0.05 ແລະ >2-fold ion intensity) ເຊັ່ນດຽວກັນກັບໂປຣຕີນ singleton ທີ່ມີພຽງແຕ່ຢູ່ໃນ miniSOG-expressing (ຮູບ 3d ຈຸດສີແດງແລະສີຂຽວ). ການວິເຄາະແຜນຜັງພູເຂົາໄຟໄດ້ສະແດງໂປຣຕີນທີ່ອຸດົມສົມບູນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (p <0.05 ແລະ >2-fold ion intensity) ເຊັ່ນດຽວກັນກັບໂປຣຕີນ singleton ທີ່ມີພຽງແຕ່ຢູ່ໃນ miniSOG-expressing (ຮູບ 3d ຈຸດສີແດງແລະສີຂຽວ). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). ການວິເຄາະແຜນຜັງພູເຂົາໄຟໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນໂປຣຕີນທີ່ອຸດົມສົມບູນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (p<0.05 ແລະ >2-fold ion intensity) ເຊັ່ນດຽວກັນກັບໂປຣຕີນດຽວທີ່ມີຢູ່ໃນສາຍ miniSOG-expressing (ຮູບ 3d, ຈຸດສີແດງແລະສີຂຽວ).火山图分析分析显示显示显着蛋白质蛋白质和和> 倍> 倍>) 以及仅仅在于在于在于在于 minisog 表达表达表达表达表达表达表达红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色和红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色红色火山图分析显示显示分析蛋白质蛋白质和和> 和> 倍>) 仅存在于在于 minisog 表达表达表达表达表达表达表达表达红色红色绿色点绿色点 ... )))))))))))))))))))))))))))))))))))) Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). ການວິເຄາະແຜນທີ່ພູເຂົາໄຟໄດ້ເປີດເຜີຍໂປຣຕີນທີ່ອຸດົມໄປດ້ວຍທາດໂປຼຕີນທີ່ອຸດົມສົມບູນ (p<0.05 ແລະ >2x ຄວາມແຮງຂອງໄອອອນ) ເຊັ່ນດຽວກັນກັບໂປຣຕີນດຽວທີ່ມີຢູ່ໃນເສັ້ນສະແດງຜົນ miniSOG (ຈຸດສີແດງ ແລະສີຂຽວໃນຮູບ 3d).ການລວມເອົາຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້, ພວກເຮົາໄດ້ກໍານົດ 1364, 461, ແລະ 911 ທີ່ສໍາຄັນທາງສະຖິຕິຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກນິວເຄລຍ, mitochondrial, ແລະ ER, ຕາມລໍາດັບ.ເພື່ອວິເຄາະຄວາມຖືກຕ້ອງຂອງ PDPL organelle-localized, ພວກເຮົາໄດ້ນໍາໃຊ້ການວິເຄາະ MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO), ແລະ A. Ting et al.ຊຸດຂໍ້ມູນ 8 ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບ mitochondria, nucleus, ແລະ ER ເພື່ອທົດສອບຄວາມສະເພາະຂອງ organelle ຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ກວດພົບ, ສອດຄ່ອງກັບຄວາມຖືກຕ້ອງຂອງ 73.4, 78.5, ແລະ 73.0% (ຮູບ 3e).ສະເພາະຂອງ PDPL ຢືນຢັນວ່າ PDPL ເປັນເຄື່ອງມືທີ່ເຫມາະສົມສໍາລັບການກໍານົດ proteomes organelles ສະເພາະ.ສັງເກດເຫັນ, ການວິເຄາະ submitochondrial ຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ mitochondrial ທີ່ໄດ້ກໍານົດໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າທາດໂປຼຕີນຈາກ trapped ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນແຈກຢາຍຢູ່ໃນ matrix ແລະເຍື່ອຊັ້ນໃນ (226 ແລະ 106, ຕາມລໍາດັບ), ກວມເອົາ 91,7% (362) ຂອງຈໍານວນທັງຫມົດຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ mitochondrial ທີ່ໄດ້ກໍານົດ.ລະດັບສູງຂອງ PDPL ໄດ້ຖືກຢືນຢັນຕື່ມອີກ (ຕື່ມຮູບທີ່ 7a).ເຊັ່ນດຽວກັນ, ການວິເຄາະ subnuclear ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ proteome ທີ່ຖືກຈັບໄດ້ຖືກແຈກຢາຍສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນຢູ່ໃນແກນ, nucleoplasm, ແລະ nucleolus (ຕື່ມ Fig. 7b).ການວິເຄາະ proteomic ນິວເຄລຍດ້ວຍ peptide ສັນຍານທ້ອງຖິ່ນຂອງນິວເຄລຍ (3xNLS) ສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມຖືກຕ້ອງທີ່ຄ້າຍຄືກັນກັບການກໍ່ສ້າງ H2B (ຮູບເພີ່ມເຕີມ 7c–h).ເພື່ອກໍານົດຄວາມສະເພາະຂອງເຄື່ອງຫມາຍ PDPL, laminin ນິວເຄລຍ A ໄດ້ຖືກເລືອກເປັນຈັ່ນຈັບ POI7 ທີ່ມີຄວາມແຕກຕ່າງໃນທ້ອງຖິ່ນຫຼາຍ.PDPL ໄດ້ກໍານົດ 36 ທາດໂປຼຕີນທີ່ອຸດົມສົມບູນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ, ໃນນັ້ນ 12 ທາດໂປຼຕີນ (30.0% ລວມທັງ lamin A) ເປັນທາດໂປຼຕີນທີ່ມີປະຕິສໍາພັນ lamin A ທີ່ມີລັກສະນະດີທີ່ລະບຸໄວ້ໂດຍຖານຂໍ້ມູນ String, ມີອັດຕາສ່ວນສູງກວ່າວິທີ BioID (122 ທາດໂປຼຕີນ) 28 ຂອງ 28, 22.9. %) 7. ວິທີການຂອງພວກເຮົາໄດ້ກໍານົດທາດໂປຼຕີນຫນ້ອຍລົງ, ອາດຈະເປັນຍ້ອນພື້ນທີ່ຕິດສະຫລາກທີ່ຈໍາກັດ, ເຊິ່ງເຮັດໃຫ້ເປັນໄປໄດ້ໂດຍອົກຊີເຈນ singlet ທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວຫຼາຍ.ການວິເຄາະ GO ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າທາດໂປຼຕີນທີ່ຖືກກໍານົດສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນຢູ່ໃນ nucleoplasm (26), ເຍື່ອນິວເຄຼຍ (10), ເຍື່ອນິວເຄຼຍ (9), ແລະຮູຂຸມຂົນນິວເຄຼຍ (5).ໂດຍລວມແລ້ວ, ທາດໂປຼຕີນຈາກນິວເຄລຍເຫຼົ່ານີ້ກວມເອົາ 80% ຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ອຸດົມສົມບູນ, ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມສະເພາະຂອງ PDPL (ຮູບພາບເສີມ 8a–d).
ໂດຍໄດ້ສ້າງຕັ້ງຄວາມສາມາດຂອງ PDPL ເພື່ອປະຕິບັດເຄື່ອງຫມາຍຄວາມໃກ້ຊິດໃນ organelles, ຫຼັງຈາກນັ້ນພວກເຮົາໄດ້ທົດສອບວ່າ PDPL ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອວິເຄາະຄູ່ຮ່ວມງານຜູກມັດ POI.ໂດຍສະເພາະ, ພວກເຮົາຊອກຫາການກໍານົດການວິເຄາະ PDPL ຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ cytosolic, ເຊິ່ງຖືວ່າເປັນເປົ້າຫມາຍທີ່ມີຄວາມຫຍຸ້ງຍາກຫຼາຍກ່ວາຄູ່ຮ່ວມງານທີ່ມີເຍື່ອເມືອກຂອງພວກມັນເນື່ອງຈາກລັກສະນະທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວສູງ.ທາດໂປຼຕີນຈາກ bromodomain ແລະ extraterminal (BET) BRD4 ໄດ້ດຶງດູດຄວາມສົນໃຈຂອງພວກເຮົາສໍາລັບບົດບາດສໍາຄັນຂອງມັນໃນພະຍາດຕ່າງໆ 35, 36 .ສະລັບສັບຊ້ອນທີ່ສ້າງຂຶ້ນໂດຍ BRD4 ເປັນ coactivator transcriptional ແລະເປັນເປົ້າຫມາຍການປິ່ນປົວທີ່ສໍາຄັນ.ໂດຍການຄວບຄຸມການສະແດງອອກຂອງປັດໃຈການຖ່າຍທອດ c-myc ແລະ Wnt5a, BRD4 ຄິດວ່າເປັນຕົວກໍານົດທີ່ສໍາຄັນຂອງ leukemia myeloid acute (AML), myeloma ຫຼາຍ, lymphoma ຂອງ Burkitt, ມະເຮັງຈໍ້າສອງເມັດແລະພະຍາດອັກເສບ37,38.ນອກຈາກນັ້ນ, ໄວຣັສບາງຊະນິດໄດ້ຕັ້ງເປົ້າໝາຍໃສ່ BRD4 ເພື່ອຄວບຄຸມການຖ່າຍທອດໄວຣັສ ແລະໂທລະສັບມືຖື, ເຊັ່ນ: papillomavirus, HIV, ແລະ SARS-CoV-236,39.
ເພື່ອສ້າງແຜນທີ່ການໂຕ້ຕອບ BRD4 ໂດຍໃຊ້ PDPL, ພວກເຮົາໄດ້ລວມ miniSOG ກັບ isoform N- ຫຼື C-terminal ສັ້ນຂອງ BRD4.ຜົນໄດ້ຮັບຂອງ Proteomic ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງລະດັບສູງຂອງການທັບຊ້ອນກັນລະຫວ່າງສອງໂຄງສ້າງ (ເພີ່ມເຕີມ Fig. 9a).ທາດໂປຼຕີນຈາກນິວເຄລຍທີ່ຖືກກໍານົດດ້ວຍ miniSOG-H2B ກວມເອົາ 77.6% ຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ພົວພັນກັບ BRD4 (ຮູບພາບເສີມ 9b).ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ເວລາທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງ illumination (2, 5, 10, 20 min) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອປັບ radius ຂອງເຄື່ອງຫມາຍ (ຮູບ 4a ແລະຂໍ້ມູນເສີມ 3).ພວກເຮົາສະຫຼຸບວ່າໃນເວລາ photoperiods ສັ້ນກວ່າ, PDPL ຕົ້ນຕໍຈະຕິດປ້າຍຊື່ຄູ່ຮ່ວມງານການຜູກມັດໂດຍກົງ, ໃນຂະນະທີ່ໄລຍະເວລາທີ່ຍາວກວ່າຈະປະກອບມີທາດໂປຼຕີນທີ່ຖືກກໍານົດໃນໄລຍະເວລາ photoactivation ສັ້ນກວ່າເຊັ່ນດຽວກັນກັບເປົ້າຫມາຍທາງອ້ອມໃນສະລັບສັບຊ້ອນການຕິດສະຫລາກ.ໃນຄວາມເປັນຈິງ, ພວກເຮົາພົບເຫັນການຊ້ອນກັນທີ່ເຂັ້ມແຂງລະຫວ່າງຈຸດເວລາໃກ້ຄຽງ (84.6% ສໍາລັບ 2 ແລະ 5 ນາທີ; 87.7% ສໍາລັບ 5 ແລະ 10 ນາທີ; 98.7% ສໍາລັບ 10 ແລະ 20 ນາທີ) (ຮູບ 4b ແລະເພີ່ມເຕີມ Fig. 9c).ໃນກຸ່ມທົດລອງທັງຫມົດ, ພວກເຮົາພົບເຫັນບໍ່ພຽງແຕ່ BRD4 ປ້າຍຊື່ຕົນເອງ, ແຕ່ເປົ້າຫມາຍທີ່ຮູ້ຈັກຈໍານວນຫນຶ່ງເຊັ່ນ: MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, ແລະ HMGB1 annotated in the string database.ຄວາມເຂັ້ມແຂງ ionic ຂອງເປົ້າຫມາຍເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນອັດຕາສ່ວນກັບເວລາ exposure (ຮູບ 4c ແລະເພີ່ມເຕີມ Fig. 9d).ການວິເຄາະ GO ຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ລະບຸໄວ້ໃນກຸ່ມ 2 ນາທີໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າທາດໂປຼຕີນທີ່ຖືກກໍານົດໄດ້ຖືກທ້ອງຖິ່ນຢູ່ໃນນິວເຄລຍແລະມີສ່ວນຮ່ວມໃນການແກ້ໄຂ chromatin ແລະຫນ້າທີ່ RNA polymerase.ການທໍາງານຂອງໂມເລກຸນຂອງທາດໂປຼຕີນແມ່ນອຸດົມສົມບູນໃນການຜູກມັດ chromatin ຫຼື coactivation transcriptional, ສອດຄ່ອງກັບຫນ້າທີ່ BRD4 (ຮູບ 4d).ການວິເຄາະປະຕິສໍາພັນທາດໂປຼຕີນທີ່ເປີດໃຊ້ດ້ວຍຖານຂໍ້ມູນ String ເປີດເຜີຍລະດັບທໍາອິດຂອງປະຕິສໍາພັນທາງອ້ອມລະຫວ່າງ BRD4 ແລະ HDAC ຄອບຄົວ interacting complexes ເຊັ່ນ SIN3A, NOR2, BCOR, ແລະ SAP130 (ຮູບ 4e ແລະເພີ່ມເຕີມ Fig. 9e), ສອດຄ່ອງກັບ BRD4 ແລະ HDAC binding acetylated histones ..ນອກຈາກນັ້ນ, ເປົ້າຫມາຍຕົວແທນທີ່ຖືກກໍານົດໂດຍ LC-MS / MS, ລວມທັງ Sin3A, NSUN2, Fus, ແລະ SFPQ, ໄດ້ຖືກຢືນຢັນໂດຍການ blotting ຕາເວັນຕົກ (ຮູບ 4f).ບໍ່ດົນມານີ້, isoform ສັ້ນຂອງ BRD4 ໄດ້ຖືກລາຍງານວ່າເປັນນິວເຄລຍທີ່ມີຄຸນສົມບັດການແຍກໄລຍະຂອງແຫຼວ (LLPS).ທາດໂປຼຕີນທີ່ຜູກມັດ RNA Fus ແລະ SFPQ ໄກ່ເກ່ຍ LLPS ຂອງຂະບວນການຈຸລັງຕ່າງໆແລະໄດ້ຖືກລະບຸຢູ່ທີ່ນີ້ວ່າເປັນທາດໂປຼຕີນທີ່ຜູກມັດ BRD4 ທີ່ບໍ່ໄດ້ບັນທຶກ.ປະຕິສໍາພັນລະຫວ່າງ BRD4 ແລະ SFPQ ໄດ້ຖືກຢືນຢັນໂດຍການທົດລອງ co-immunoprecipitation (co-IP) (ຮູບ 4g), ແນະນໍາກົນໄກອື່ນສໍາລັບການແຍກໄລຍະຂອງແຫຼວທີ່ເປັນກາງຂອງ BRD4 ທີ່ສົມຄວນໄດ້ຮັບການສືບສວນຕື່ມອີກ.ຮ່ວມກັນ, ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ PDPL ເປັນເວທີທີ່ເຫມາະສົມສໍາລັບການກໍານົດການພົວພັນ BRD4 ທີ່ຮູ້ຈັກເຊັ່ນດຽວກັນກັບທາດໂປຼຕີນທີ່ຜູກມັດທີ່ບໍ່ຮູ້ຈັກ.
ການສະແດງແບບແຜນຂອງເຄື່ອງໝາຍຄວາມໃກ້ຊິດ BRD4 ທີ່ໃຊ້ miniSOG-mediated, ເວລາເປີດຮັບແສງ: 2, 5, 10, ແລະ 20 ນາທີ.b ການຊ້ອນກັນຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ກໍານົດໃນເວລາການສະຫວ່າງທີ່ແຕກຕ່າງກັນ.ການເສີມທາດໂປຼຕີນທີ່ລະບຸໄວ້ໃນ HEK293T-miniSOG-BRD4 ແມ່ນມີຄວາມສໍາຄັນທາງສະຖິຕິເມື່ອທຽບກັບ HEK293T ປະເພດທໍາມະຊາດ.c ຄວາມເຂັ້ມຂອງທາດໄອອອນໃນເວລາທີ່ການຄິດໄລ່ຕົວແທນທີ່ບໍ່ມີປ້າຍຊື່ທີ່ຮູ້ຈັກທາດໂປຼຕີນທີ່ຜູກມັດ BRD4 ໃນໄລຍະເວລາທີ່ກໍານົດໄວ້.n = 3 ຕົວຢ່າງທີ່ເປັນເອກະລາດທາງຊີວະພາບ.ຂໍ້ມູນຖືກນໍາສະເຫນີເປັນຄ່າສະເລ່ຍ ± deviation ມາດຕະຖານ.d ການວິເຄາະ Gene ontological (GO) ຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ລະບຸໄວ້ໃນກຸ່ມ 2 ນາທີ.ສິບເງື່ອນໄຂ GO ທໍາອິດຖືກລະບຸໄວ້.ຟອງແມ່ນສີຕາມປະເພດຄໍາສັບ GO, ແລະຂະຫນາດຂອງຟອງແມ່ນອັດຕາສ່ວນກັບຈໍານວນຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ພົບໃນແຕ່ລະໄລຍະ.e ການວິເຄາະສາຍຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ພົວພັນກັບ BRD4.ວົງສີເຫຼືອງແມ່ນກາວໂດຍກົງແລະວົງສີຂີ້ເຖົ່າແມ່ນຊັ້ນທໍາອິດຂອງກາວທາງອ້ອມ.ເສັ້ນສີແດງເປັນຕົວແທນຂອງປະຕິສໍາພັນທີ່ກໍານົດໃນການທົດລອງແລະເສັ້ນສີຟ້າເປັນຕົວແທນຂອງການໂຕ້ຕອບທີ່ຄາດຄະເນ.f ຜູ້ຕາງຫນ້າ BRD4 ເປົ້າຫມາຍຜູກມັດທີ່ລະບຸໄວ້ໃນ LC-MS / MS ໄດ້ຖືກກວດສອບໂດຍການ blotting ຕາເວັນຕົກ.g ການທົດລອງຮ່ວມ immunoprecipitation ຢືນຢັນການໂຕ້ຕອບລະຫວ່າງ SFPQ ແລະ BRD4.ການທົດລອງເຫຼົ່ານີ້ຖືກເຮັດຊ້ຳຢ່າງເປັນອິດສະຫຼະຢ່າງໜ້ອຍສອງຄັ້ງດ້ວຍຜົນໄດ້ຮັບທີ່ຄ້າຍຄືກັນ.ຂໍ້ມູນດິບແມ່ນສະຫນອງໃຫ້ໃນຮູບແບບຂອງໄຟລ໌ຂໍ້ມູນດິບ.
ນອກເຫນືອຈາກການກໍານົດເປົ້າຫມາຍທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ POI ທີ່ບໍ່ລົງທະບຽນ, ພວກເຮົາສົມມຸດຕິຖານວ່າ PDPL ຈະເຫມາະສົມສໍາລັບການກໍານົດ substrates ສໍາລັບ enzymes, ເຊິ່ງຕ້ອງການລັກສະນະຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ຜູກມັດທາງອ້ອມໃນສະລັບສັບຊ້ອນຂະຫນາດໃຫຍ່ເພື່ອອະທິບາຍ substrates ບໍ່ໄດ້ລົງທະບຽນ.Parkin (ເຂົ້າລະຫັດໂດຍ PARK2) ແມ່ນ E3 ligase ແລະການກາຍພັນໃນ parkin ເປັນທີ່ຮູ້ຈັກທີ່ຈະເຮັດໃຫ້ເກີດ autosomal recessive juvenile Parkinson's disease (AR-JP)42.ນອກຈາກນັ້ນ, parkin ໄດ້ຖືກອະທິບາຍວ່າເປັນສິ່ງຈໍາເປັນສໍາລັບ mitophagy (mitochondrial autophagy) ແລະການກໍາຈັດຊະນິດຂອງອົກຊີເຈນທີ່ມີປະຕິກິລິຍາ.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ເຖິງແມ່ນວ່າ substrates parkin ຫຼາຍໄດ້ຖືກລະບຸ, ບົດບາດຂອງ parkin ໃນພະຍາດນີ້ຍັງບໍ່ຈະແຈ້ງ.ເພື່ອອະທິບາຍ substrates uncharacterized ຂອງມັນ, PDPL ໄດ້ຖືກທົດສອບໂດຍການເພີ່ມ miniSOG ໃສ່ N- ຫຼື C-terminus ຂອງ parkin.ເຊລຖືກປະຕິບັດດ້ວຍຕົວຂົນສົ່ງໂປຣຕິນ carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) ເພື່ອເປີດໃຊ້ parkin ຜ່ານເສັ້ນທາງ PINK1-Parkin.ເມື່ອປຽບທຽບກັບຜົນໄດ້ຮັບ BRD4 PDPL ຂອງພວກເຮົາ, parkin N-terminus fusion ໄດ້ເປີດເຜີຍຊຸດໂປຣຕີນທີ່ໃຫຍ່ກວ່າ, ເຖິງແມ່ນວ່າມັນໄດ້ກວມເອົາສ່ວນໃຫຍ່ຂອງ C-terminus (177 ອອກຈາກ 210) (ຮູບ 5a, b ແລະຂໍ້ມູນເສີມ 4).ຜົນໄດ້ຮັບແມ່ນສອດຄ່ອງກັບບົດລາຍງານທີ່ N-terminal tags ສາມາດເປີດໃຊ້ Parkin44 ຢ່າງຜິດຫວັງ.ເປັນເລື່ອງແປກທີ່, ມີພຽງແຕ່ 18 ທາດໂປຼຕີນທີ່ທັບຊ້ອນກັນໃນຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາກັບຜົນໄດ້ຮັບ AP-MS ທີ່ຖືກເຜີຍແຜ່ສໍາລັບ Parkin43, ອາດຈະເປັນຍ້ອນຄວາມແຕກຕ່າງລະຫວ່າງເສັ້ນຈຸລັງແລະຂະບວນການເຮັດວຽກຂອງ proteomics.ນອກເຫນືອຈາກສີ່ທາດໂປຼຕີນທີ່ຮູ້ຈັກ (ARDM1, HSPA8, PSMD14, ແລະ PSMC3) ທີ່ຖືກກໍານົດໂດຍສອງວິທີ (ຮູບ 5c)43.ເພື່ອກວດສອບຜົນຂອງ LC-MS/MS ຕື່ມອີກ, ການປິ່ນປົວ PDPL ແລະການທາບທາມຕາເວັນຕົກຕໍ່ມາໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອປຽບທຽບຜົນໄດ້ຮັບຂອງການວິເຄາະຈຸລັງແມ່ຂອງ HEK293T ແລະເສັ້ນ N-terminal parkin ທີ່ຫມັ້ນຄົງ.ເປົ້າໝາຍທີ່ບໍ່ຮູ້ມາກ່ອນ CDK2, DUT, CTBP1, ແລະ PSMC4 ໄດ້ຖືກທົດສອບດ້ວຍຕົວຜູກທີ່ຮູ້ຈັກ, DNAJB1 (ຮູບ 5d).
ແຜນຜັງພູເຂົາໄຟຂອງໂປຣຕີນທີ່ມີປະຕິກິລິຍາຕໍ່ ​​parkin ໃນຈຸລັງ HEK293T ທີ່ມີ miniSOG ສະແດງອອກຢ່າງຫມັ້ນຄົງ fused ກັບ N- ຫຼື C-terminus ຂອງ parkin (n = 3 ການທົດລອງທາງຊີວະພາບເອກະລາດ).ການທົດສອບ t ຂອງນັກຮຽນສອງຫາງໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ໃນພື້ນທີ່ຂອງພູເຂົາໄຟ.HEK293T ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນການຄວບຄຸມທາງລົບ. ໂປຣຕີນທີ່ມີການປ່ຽນແປງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍແມ່ນເນັ້ນໃສ່ເປັນສີແດງ (p < 0.05 ແລະ > ຄວາມແຕກຕ່າງຄວາມເຂັ້ມຂອງທາດໄອອອນ 2 ເທົ່າ). ໂປຣຕີນທີ່ມີການປ່ຽນແປງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍແມ່ນເນັ້ນໃສ່ເປັນສີແດງ (p < 0.05 ແລະ > ຄວາມແຕກຕ່າງຄວາມເຂັ້ມຂອງທາດໄອອອນ 2 ເທົ່າ). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 ແລະ >2-кратная разница в интенсивиност). ໂປຣຕີນທີ່ມີການປ່ຽນແປງຢ່າງມີໄນສໍາຄັນແມ່ນເນັ້ນໃສ່ເປັນສີແດງ (p < 0.05 ແລະ > ຄວາມແຕກຕ່າງຂອງຄວາມເຂັ້ມຂອງທາດໄອອອນ 2 ເທົ່າ).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 ແລະ > 2-кратная разница в ионной силе). ທາດໂປຼຕີນທີ່ມີການປ່ຽນແປງຢ່າງມີໄນສໍາຄັນແມ່ນເນັ້ນໃສ່ເປັນສີແດງ (p < 0.05 ແລະ > ຄວາມແຕກຕ່າງ 2 ເທົ່າຂອງຄວາມເຂັ້ມແຂງ ionic).ໂປຣຕີນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງທີ່ສໍາຄັນສໍາລັບ HEK293T-miniSOG ແຕ່ບໍ່ສໍາຄັນສໍາລັບ HEK293T ແມ່ນສະແດງເປັນສີຂຽວ.b ແຜນວາດ Venn ສະແດງໂປຣຕີນທີ່ທັບຊ້ອນກັນລະຫວ່າງໂຄງສ້າງ N-terminal ແລະ C-terminal.N-terminal tags ສາມາດເປີດໃຊ້ parkin ຜິດຫວັງ ແລະສົ່ງຜົນໃຫ້ໂປຣຕີນທີ່ຮັບຮູ້ໄດ້ຫຼາຍຂຶ້ນ.c ແຜນວາດ Venn ສະແດງໂປຣຕີນທີ່ທັບຊ້ອນກັນລະຫວ່າງ PDPL ແລະ AP-MS.ປະຕິສໍາພັນທີ່ຮູ້ຈັກໄດ້ຖືກລະບຸໄວ້, ລວມທັງ 4 ໃນ 18 ທາດໂປຼຕີນທີ່ທັບຊ້ອນກັນແລະ 11 ໃນ 159 ທາດໂປຼຕີນທີ່ຖືກກໍານົດໂດຍສະເພາະໃນ PDPL.d ເປົ້າຫມາຍຕົວແທນທີ່ຖືກກໍານົດໂດຍ LC-MS / MS ໄດ້ຖືກກວດສອບໂດຍການ blotting ຕາເວັນຕົກ.e Ssu72 ແລະ SNW1 ຖືກລະບຸວ່າເປັນ substrates parkin ທີ່ບໍ່ໄດ້ລົງທະບຽນ.plasmids ທາດໂປຼຕີນຈາກ FLAG ເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ຖືກຖ່າຍທອດເຂົ້າໄປໃນ HEK293T ແລະ HEK293T-Parkin-miniSOG ຕິດຕາມດ້ວຍການປິ່ນປົວ CCCP ໃນຈຸດເວລາຕ່າງໆ.ການເຊື່ອມໂຊມໄດ້ຊັດເຈນຂຶ້ນຢູ່ໃນເສັ້ນ Parkin overexpression.f ການນໍາໃຊ້ຕົວຍັບຍັ້ງ proteasome MG132, ມັນໄດ້ຖືກຢືນຢັນວ່າຂະບວນການຍ່ອຍສະຫຼາຍຂອງ Ssu72 ແລະ SNW1 ແມ່ນ mediated ໂດຍ proteasome-ubiquitination.ການທົດລອງເຫຼົ່ານີ້ຖືກເຮັດຊ້ຳຢ່າງເປັນອິດສະຫຼະຢ່າງໜ້ອຍສອງຄັ້ງດ້ວຍຜົນໄດ້ຮັບທີ່ຄ້າຍຄືກັນ.ຂໍ້ມູນດິບແມ່ນສະຫນອງໃຫ້ໃນຮູບແບບຂອງໄຟລ໌ຂໍ້ມູນດິບ.
ໂດຍສະເພາະ, ທາດໂປຼຕີນທີ່ຖືກກໍານົດໂດຍ PDPL ຈະຕ້ອງປະກອບມີທາດໂປຼຕີນທີ່ຜູກມັດ parkin ແລະທາດຍ່ອຍຂອງມັນ.ເພື່ອກວດຫາສານຍ່ອຍ Parkin ທີ່ບໍ່ໄດ້ລົງທະບຽນ, ພວກເຮົາໄດ້ເລືອກທາດໂປຼຕີນ 7 ຊະນິດ (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 ແລະ SNW1) ແລະ plasmids ທີ່ຖືກຖ່າຍທອດເພື່ອເປີດເຜີຍ genes ເຫຼົ່ານີ້ໄປສູ່ HEK293T ປົກກະຕິແລະສະແດງອອກຢ່າງຫມັ້ນຄົງ ການປິ່ນປົວ miniSOG-Parkin's H2CP9.ລະດັບຂອງໂປຣຕີນ Ssu72 ແລະ SNW1 ໄດ້ຖືກຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນສາຍ miniSOG-Parkin ທີ່ຫມັ້ນຄົງ (ຮູບ 5e).ການປິ່ນປົວດ້ວຍ CCCP ເປັນເວລາ 12 ຊົ່ວໂມງເຮັດໃຫ້ການເສື່ອມໂຊມທີ່ສໍາຄັນທີ່ສຸດຂອງສານຍ່ອຍທັງສອງ.ເພື່ອສືບສວນວ່າການເຊື່ອມໂຊມຂອງ Ssu72 ແລະ SNW1 ຖືກຄວບຄຸມໂດຍ proteasome-ubiquitination, proteasome inhibitor MG132 ໄດ້ຖືກເພີ່ມເພື່ອຍັບຍັ້ງກິດຈະກໍາຂອງ proteasome, ແລະໃນຄວາມເປັນຈິງພວກເຮົາພົບວ່າຂະບວນການຍ່ອຍສະຫຼາຍຂອງພວກມັນຖືກຍັບຍັ້ງ (ຮູບ 5f).ເປົ້າຫມາຍທີ່ບໍ່ແມ່ນ substrate ເພີ່ມເຕີມໄດ້ຖືກຢືນຢັນເປັນຕົວໂຕ້ຕອບ Parkin ໂດຍໃຊ້ blotting ຕາເວັນຕົກ (ເພີ່ມເຕີມ Fig. 10), ເຊິ່ງສະແດງໃຫ້ເຫັນຜົນໄດ້ຮັບທີ່ສອດຄ່ອງກັບ LC-MS / MS.ສະຫຼຸບແລ້ວ, ການເຊື່ອມໂຍງຂອງຂະບວນການເຮັດວຽກຂອງ PDPL ກັບການກວດສອບການຖ່າຍທອດທາດໂປຼຕີນຈາກເປົ້າຫມາຍອະນຸຍາດໃຫ້ການກໍານົດຂອງ substrates E3 ligase ບໍ່ໄດ້ລົງທະບຽນ.
ພວກ​ເຮົາ​ໄດ້​ພັດ​ທະ​ນາ​ເປັນ​ເວ​ທີ​ການ​ເຄື່ອງ​ຫມາຍ​ຄວາມ​ໃກ້​ຄຽງ​ທົ່ວ​ໄປ​ທີ່​ອະ​ນຸ​ຍາດ​ໃຫ້​ທ່ານ​ເພື່ອ​ກໍາ​ນົດ​ຢູ່​ໃນ​ຊ່ອງ​ແລະ​ເວ​ລາ​ການ​ພົວ​ພັນ POIs.ເວທີດັ່ງກ່າວແມ່ນອີງໃສ່ທາດໂປຼຕີນຈາກ photosensitizer miniSOG, ເຊິ່ງມີພຽງແຕ່ປະມານ 12 kDa, ຫນ້ອຍກວ່າເຄິ່ງຫນຶ່ງຂອງ enzyme APEX2 ແກ່ (27 kDa) ແລະຫນຶ່ງໃນສາມຂະຫນາດຂອງ TurboID (35 kDa).ຂະ​ຫນາດ​ນ້ອຍ​ຄວນ​ຈະ​ຂະ​ຫຍາຍ​ຕົວ​ຢ່າງ​ຫຼວງ​ຫຼາຍ​ຂອງ​ຄໍາ​ຮ້ອງ​ສະ​ຫມັກ​ສໍາ​ລັບ​ການ​ສຶກ​ສາ interactomes ທາດ​ໂປຼ​ຕີນ​ຈາກ​ຂະ​ຫນາດ​ນ້ອຍ​.ການຂຸດຄົ້ນເພີ່ມເຕີມຂອງ photosensitizers ເພີ່ມເຕີມ, ບໍ່ວ່າຈະເປັນໂປຣຕີນທີ່ເຂົ້າລະຫັດພັນທຸກໍາຫຼືໂມເລກຸນຂະຫນາດນ້ອຍ, ແມ່ນຈໍາເປັນເພື່ອເພີ່ມຜົນຜະລິດ quantum ຂອງອົກຊີເຈນທີ່ singlet ແລະຂະຫຍາຍຄວາມອ່ອນໄຫວຂອງວິທີການນີ້.ສໍາລັບ miniSOG ສະບັບປະຈຸບັນ, ການແກ້ໄຂຊົ່ວຄາວສູງສາມາດບັນລຸໄດ້ໂດຍໃຊ້ການສ່ອງແສງສີຟ້າເພື່ອເປີດໃຊ້ເຄື່ອງຫມາຍຄວາມໃກ້ຊິດ.ນອກຈາກນັ້ນ, ເວລາສໍາຜັດທີ່ຍາວກວ່າປ່ອຍອອກ "ຟັງ" ຂອງອົກຊີເຈນທີ່ຂະຫນາດໃຫຍ່ກວ່າ, ເຊິ່ງກໍ່ໃຫ້ເກີດການດັດແກ້ຂອງ residues histidine distal ຫຼາຍ, radius ການຕິດສະຫລາກເພີ່ມຂຶ້ນ, ແລະຄວາມສາມາດໃນການປັບຄວາມລະອຽດທາງກວ້າງຂອງ PDPL.ພວກເຮົາຍັງໄດ້ທົດສອບ 7 probes ສານເຄມີເພື່ອເພີ່ມອັດຕາສ່ວນສັນຍານກັບພື້ນຫລັງແລະຂຸດຄົ້ນກົນໄກໂມເລກຸນທີ່ຢູ່ເບື້ອງຫຼັງວິທີການນີ້.ຂະບວນການເຮັດວຽກຂອງ TOP-ABPP ບວກກັບການຄົ້ນຫາແບບເປີດທີ່ບໍ່ເປັນກາງໄດ້ຢືນຢັນວ່າການດັດແກ້ເກີດຂຶ້ນພຽງແຕ່ໃນ histidines ແລະບໍ່ມີ microenvironment ທີ່ສອດຄ່ອງໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນສໍາລັບການດັດແກ້ histidine ເພີ່ມຂຶ້ນ, ຍົກເວັ້ນຄວາມມັກປານກາງສໍາລັບ histidines ໃນພາກພື້ນ loop.
PDPL ຍັງໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກໍານົດຕົວ proteomes subcellular ທີ່ມີຄວາມສະເພາະຂອງ proteome ແລະການຄຸ້ມຄອງຢ່າງຫນ້ອຍເມື່ອທຽບກັບການຕິດສະຫຼາກໃກ້ຄຽງອື່ນໆແລະວິທີການ probe ສານເຄມີສະເພາະຂອງ organelle.ເຄື່ອງໝາຍຄວາມໃກ້ຊິດຍັງຖືກໃຊ້ຢ່າງສຳເລັດຜົນເພື່ອສະແດງລັກສະນະພື້ນຜິວ, lysosomal, ແລະ proteomes ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ secretome46,47.ພວກເຮົາເຊື່ອວ່າ PDPL ຈະເຂົ້າກັນໄດ້ກັບອະໄວຍະວະຍ່ອຍເຫຼົ່ານີ້.ນອກຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ທ້າທາຍ PDPL ໂດຍການກໍານົດເປົ້າຫມາຍສໍາລັບການຜູກມັດທາດໂປຼຕີນຈາກ cytosolic ທີ່ມີຄວາມຊັບຊ້ອນຫຼາຍກ່ວາທາດໂປຼຕີນຈາກເຍື່ອຫຸ້ມເນື່ອງຈາກຄຸນສົມບັດແບບເຄື່ອນໄຫວແລະການມີສ່ວນຮ່ວມໃນການພົວພັນທາງໂລກຫຼາຍຂຶ້ນ.PDPL ຖືກນໍາໃຊ້ກັບສອງທາດໂປຼຕີນ, ຕົວກະຕຸ້ນການຖອດຂໍ້ຄວາມ BRD4 ແລະ ligase E3 Parkin ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບພະຍາດ.ທາດໂປຼຕີນທັງສອງນີ້ໄດ້ຖືກເລືອກບໍ່ພຽງແຕ່ສໍາລັບຫນ້າທີ່ທາງຊີວະພາບພື້ນຖານຂອງພວກເຂົາ, ແຕ່ຍັງສໍາລັບຄວາມກ່ຽວຂ້ອງທາງດ້ານຄລີນິກແລະທ່າແຮງການປິ່ນປົວຂອງພວກເຂົາ.ສໍາລັບສອງ POIs ເຫຼົ່ານີ້, ຄູ່ຮ່ວມງານຜູກມັດທີ່ມີຊື່ສຽງເຊັ່ນດຽວກັນກັບເປົ້າຫມາຍທີ່ບໍ່ໄດ້ລົງທະບຽນໄດ້ຖືກກໍານົດ.ເປັນທີ່ຫນ້າສັງເກດ, SFPQ ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການແຍກທາດໂປຼຕີນຈາກໄລຍະໄດ້ຖືກຢືນຢັນໂດຍ co-IP, ເຊິ່ງອາດຈະຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງກົນໄກໃຫມ່ທີ່ BRD4 ( isoform ສັ້ນ) ຄວບຄຸມ LLPS.ໃນຂະນະດຽວກັນ, ພວກເຮົາເຊື່ອວ່າການກໍານົດຕົວຍ່ອຍຂອງ Parkin ແມ່ນສະຖານະການທີ່ຈະຕ້ອງກໍານົດການຍຶດຕິດທາງອ້ອມ.ພວກເຮົາໄດ້ກໍານົດສອງຊັ້ນຍ່ອຍ parkin ທີ່ບໍ່ລະບຸຕົວຕົນແລະຢືນຢັນການເຊື່ອມໂຊມຂອງພວກມັນຕາມເສັ້ນທາງ ubiquitination-proteasome.ບໍ່ດົນມານີ້, ຍຸດທະສາດການໃສ່ກັບດັກທີ່ອີງໃສ່ກົນໄກໄດ້ຖືກພັດທະນາເພື່ອກວດພົບສານຍ່ອຍ hydrolase ໂດຍການຈັບພວກມັນດ້ວຍ enzymes.ເຖິງແມ່ນວ່ານີ້ແມ່ນວິທີການທີ່ມີປະສິດທິພາບຫຼາຍ, ມັນບໍ່ເຫມາະສົມສໍາລັບການວິເຄາະຂອງ substrates ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການສ້າງຕັ້ງຂອງສະລັບສັບຊ້ອນຂະຫນາດໃຫຍ່ແລະຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີການສ້າງພັນທະບັດ covalent ລະຫວ່າງ enzyme ແລະ substrate ໄດ້.ພວກເຮົາຄາດຫວັງວ່າ PDPL ສາມາດຂະຫຍາຍອອກໄປເພື່ອສຶກສາສະລັບສັບຊ້ອນທາດໂປຼຕີນແລະຄອບຄົວ enzyme, ເຊັ່ນ deubiquitinase ແລະຄອບຄົວ metalloprotease.
ຮູບແບບໃຫມ່ຂອງ miniSOG, ເອີ້ນວ່າ SOPP3, ໄດ້ຖືກພັດທະນາໂດຍການປັບປຸງການຜະລິດອົກຊີເຈນ singlet.ພວກເຮົາສົມທຽບ miniSOG ກັບ SOPP3 ແລະພົບວ່າການປັບປຸງການປະຕິບັດເຄື່ອງຫມາຍ, ເຖິງແມ່ນວ່າອັດຕາສ່ວນຂອງສັນຍານກັບສິ່ງລົບກວນຍັງຄົງບໍ່ປ່ຽນແປງ (ຮູບພາບເສີມ 11).ພວກເຮົາສົມມຸດວ່າການເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງ SOPP3 (ຕົວຢ່າງ, ໂດຍຜ່ານການວິວັດທະນາການໂດຍກົງ) ຈະເຮັດໃຫ້ໂປຣຕີນທີ່ມີ photosensitizer ມີປະສິດທິພາບຫຼາຍຂຶ້ນ, ເຊິ່ງຕ້ອງການເວລາແສງສະຫວ່າງສັ້ນກວ່າແລະດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງອະນຸຍາດໃຫ້ຂະບວນການ cellular ເຄື່ອນໄຫວຫຼາຍທີ່ຈະຈັບໄດ້.ໂດຍສະເພາະແມ່ນ, ສະບັບປະຈຸບັນຂອງ PDPL ໄດ້ຖືກຈໍາກັດຢູ່ໃນສະພາບແວດລ້ອມຂອງຈຸລັງຍ້ອນວ່າມັນຕ້ອງການແສງສະຫວ່າງສີຟ້າແລະບໍ່ສາມາດເຂົ້າໄປໃນເນື້ອເຍື່ອເລິກໄດ້.ຄຸນສົມບັດນີ້ຂັດຂວາງການນໍາໃຊ້ຂອງມັນໃນການສຶກສາຕົວແບບສັດ.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ການປະສົມປະສານຂອງ optogenetics ກັບ PDPL ສາມາດໃຫ້ໂອກາດສໍາລັບການຄົ້ນຄວ້າສັດ, ໂດຍສະເພາະໃນສະຫມອງ.ນອກຈາກນັ້ນ, ເຄື່ອງກວດຈັບແສງອິນຟາເຣດທີ່ສ້າງດ້ວຍວິສະວະກໍາອື່ນໆຍັງເອົາຂໍ້ຈໍາກັດນີ້ອອກ.ປະຈຸບັນນີ້ ການຄົ້ນຄວ້າພວມດຳເນີນຢູ່ໃນຂົງເຂດນີ້.
ສາຍເຊລ HEK293T ໄດ້ມາຈາກ ATCC (CRL-3216).ເສັ້ນເຊລໄດ້ທົດສອບເປັນລົບສໍາລັບການຕິດເຊື້ອ mycoplasma ແລະຖືກນໍາໄປລ້ຽງໃນ DMEM (Thermo, #C11995500BT) ເສີມດ້ວຍ 10% ເຊຣັມ bovine fetal (FBS, Vistech, #SE100-B) ແລະ 1% penicillin/streptomycin (Hyclone, #SV30010).ປູກຢູ່ໃນ.
3-Aminophenylene (ຕົວຢ່າງ 3) ແລະ (4-ethynylphenyl) methanamine (ຕົວຢ່າງ 4) ຖືກຊື້ຈາກ Bidepharm.Propylamine (probe 2) ໄດ້ຊື້ຈາກ Energy-chemicals.N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (probe 1) ຖືກສັງເຄາະຕາມວິທີການທີ່ເຜີຍແຜ່.
ຕາຕະລາງເສີມ 1 ລາຍຊື່ໂຄງສ້າງພັນທຸກໍາທີ່ໃຊ້ໃນການສຶກສານີ້.ລຳດັບ miniSOG ແລະ KillerRed ໄດ້ຖືກໂຄນຈາກ plasmid ຂອງຂວັນຈາກ P. Zou (ມະຫາວິທະຍາໄລປັກກິ່ງ).ລໍາດັບການກໍາຫນົດເປົ້າຫມາຍ mitochondrial matrix ໄດ້ມາຈາກ 23 N-terminal ອາຊິດ amino ຂອງ COX4 ແລະ cloned ເຂົ້າໄປໃນ vectors ທີ່ລະບຸໂດຍໃຊ້ Gibson ປະກອບ (Beyotime, #D7010S).ເພື່ອແນເປົ້າໃສ່ເຍື່ອ ແລະນິວເຄລຍຂອງ endoplasmic reticulum, SEC61B DNA ຂອງມະນຸດ (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) ຂະຫຍາຍໂດຍ PCR ຈາກຫ້ອງສະໝຸດ cDNA ຂອງຈຸລັງ HEK293T, ແລະ H2B DNA (ບໍລິຈາກໂດຍ D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) ແລະ cloned, ດັ່ງທີ່ໄດ້ກ່າວມາຂ້າງເທິງ.ເວັ້ນເສຍແຕ່ໄດ້ລະບຸໄວ້ເປັນຢ່າງອື່ນ, genes ທາດໂປຼຕີນອື່ນໆທີ່ໃຊ້ສໍາລັບການຖ່າຍທອດແລະການກໍ່ສ້າງສາຍເຊນຄົງທີ່ໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍ PCR ຈາກຫ້ອງສະຫມຸດ cDNA ເຊນ HEK293T.G3S (GGGS) ແລະ G4S (GGGGS) ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນຕົວເຊື່ອມຕໍ່ລະຫວ່າງທາດໂປຼຕີນຈາກ bait ແລະ miniSOG.A V5 epitope tag (GKPIPNPLLGLDST) ໄດ້ຖືກເພີ່ມໃສ່ໂຄງສ້າງ fusion ເຫຼົ່ານີ້.ສໍາລັບການສະແດງອອກໃນສັດລ້ຽງລູກດ້ວຍນົມແລະເພື່ອສ້າງສາຍເຊນທີ່ຫມັ້ນຄົງ, ໂຄງສ້າງຟິວຊັນ miniSOG ໄດ້ຖືກຍ່ອຍເຂົ້າໄປໃນ vector lentiviral pLX304.ສໍາລັບການສະແດງອອກຂອງເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ, miniSOG ໄດ້ຖືກໂຄນເຂົ້າໄປໃນ vector pET21a ທີ່ມີປ້າຍຊື່ 6xHis ຢູ່ C-terminus.
ຈຸລັງ HEK293T ໄດ້ຖືກແກ່ນດ້ວຍເມັດໃນ 2.0 x 105 ເຊລຕໍ່ດີໃນແຜ່ນຫົກດີແລະຖ່າຍທອດ 24 ຊົ່ວໂມງຕໍ່ມາດ້ວຍ plasmids lentiviral recombinant (2.4 μg pLX304) ແລະ plasmids ຫຸ້ມຫໍ່ໄວຣັສ (1.5 μg psMD 2 ແລະ 1.20 μg) ໄລຍະເວລາ 1.2 μg. , #C0533), ປະມານ 80% fusion.ຫຼັງ​ຈາກ​ການ​ຖ່າຍ​ໂອນ​ໃນ​ຕອນ​ກາງ​ຄືນ​, ຂະ​ຫນາດ​ກາງ​ໄດ້​ຮັບ​ການ​ປ່ຽນ​ແປງ​ແລະ incubated ສໍາ​ລັບ​ອີກ 24 ຊົ່ວ​ໂມງ​.ການ​ເກັບ​ກໍາ​ເຊື້ອ​ໄວຣ​ັ​ສ​ໄດ້​ຖືກ​ປະ​ຕິ​ບັດ​ຫຼັງ​ຈາກ 24, 48 ແລະ 72 ຊົ່ວ​ໂມງ.ກ່ອນທີ່ຈະຕິດເຊື້ອຂອງສາຍຈຸລັງເປົ້າຫມາຍ, ສື່ໄວຣັສໄດ້ຖືກກັ່ນຕອງຜ່ານການກັ່ນຕອງ 0.8 μm (Merck, #millex-GP) ແລະ polybrine (Solarbio, #H8761) ໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໄປໃນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ 8 μg / ml.ຫຼັງຈາກ 24 ຊົ່ວໂມງ, ຈຸລັງໄດ້ຖືກອະນຸຍາດໃຫ້ຟື້ນຕົວໂດຍການປ່ຽນຂະຫນາດກາງ.ຈຸລັງໄດ້ຖືກເລືອກໂດຍໃຊ້ blasticidin 5 μg/ml (Solarbio, #3513-03-9) ສໍາລັບສາມ passages ທໍາອິດເປັນການຄັດເລືອກທີ່ເຂັ້ມງວດຕ່ໍາກວ່າ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ການນໍາໃຊ້ 20 μg / ml ເປັນລະບຽບການທີ່ເຂັ້ມງວດຫຼາຍສໍາລັບສາມ passages ຕໍ່ໄປ.
ຈຸລັງໄດ້ຖືກແກ່ນຢູ່ໃນຫ້ອງ 12 ຂຸມ (Ibidi, #81201) ທີ່ມີຄວາມຫນາແຫນ້ນປະມານ 20,000 ເຊນຕໍ່ດີ.ເພື່ອປັບປຸງການຍຶດຕິດຂອງຈຸລັງ HEK293T, ເພີ່ມ 50 µg/ml fibronectin (Corning, #356008) ເຈືອຈາງໃນ phosphate buffered saline (PBS, Sangon, #B640435) ທີ່ 37 ° C.ຫ້ອງໄດ້ຖືກ pretreated ສໍາລັບ 1 ຊົ່ວໂມງແລະຫຼັງຈາກນັ້ນເອົາອອກດ້ວຍ PBS.ຫຼັງຈາກ 24 ຊົ່ວໂມງ, ຈຸລັງໄດ້ຖືກລ້າງຫນຶ່ງຄັ້ງດ້ວຍ PBS, incubated ກັບ 1 mM probe 3 ໃນການແກ້ໄຂເກືອທີ່ສົມດູນຂອງ Hanks ສົດ (HBSS, Gibco, #14025092) ສໍາລັບ 1 h ທີ່ 37 ° C, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນ incubated ກັບ LED ສີຟ້າ (460 nm. ).) ຖືກ irradiated ສໍາລັບ 10 ນາທີຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຈຸລັງໄດ້ຖືກລ້າງສອງຄັ້ງດ້ວຍ PBS ແລະແກ້ໄຂດ້ວຍ 4% formaldehyde ໃນ PBS (Sangon, #E672002) ສໍາລັບ 15 ນາທີໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.formaldehyde ເກີນໄດ້ຖືກໂຍກຍ້າຍອອກຈາກຈຸລັງຄົງທີ່ໂດຍການລ້າງສາມຄັ້ງດ້ວຍ PBS.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຈຸລັງໄດ້ຖືກ permeabilized ດ້ວຍ 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) ໃນ PBS ແລະລ້າງ 3 ເທື່ອດ້ວຍ PBS.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ເອົາຫ້ອງອອກແລະຕື່ມໃສ່ແຕ່ລະຕົວຢ່າງ 25 µl ຂອງປະສົມປະຕິກິລິຍາຄລິກທີ່ປະກອບດ້ວຍ 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) ແລະ 0.5 mg/ml sodium ascorbate (Aladdin, no. S105024) ແລະ incubated 30 ນາທີຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.ຫຼັງຈາກປະຕິກິລິຍາ snap, ຈຸລັງຖືກລ້າງຫົກເທື່ອດ້ວຍ PBS ທີ່ມີ 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຖືກສະກັດດ້ວຍ 5% BSA (Abcone, #B24726) ໃນ PBST ສໍາລັບ 30 ນາທີໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.
ສໍາລັບການສ້າງພູມຕ້ານທານ colocalization, ຈຸລັງໄດ້ຖືກ incubated ດ້ວຍພູມຕ້ານທານຕົ້ນຕໍຕາມເງື່ອນໄຂທີ່ລະບຸໄວ້: mouse anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), rabbit anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), ພູມຕ້ານທານຂອງກະຕ່າຍ polyclonal anti-calnexin (1:500, Abcam, #ab22595) ຫຼື rabbit anti-lamin A/C monoclonal antibody (1:500; CST, #2032) ຢູ່ທີ່ 4 °C ໃນຄືນ.ຫຼັງຈາກລ້າງ 3 ເທື່ອດ້ວຍ PBST, ຈຸລັງໄດ້ຖືກ incubated ດ້ວຍພູມຕ້ານທານຂັ້ນສອງ: ແບ້ຕ້ານ rabbit Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) diluted 1:1000, ແບ້ຕ້ານຫນູ Alexa Fluor 594 (CST, #8889) diluted 1:1000.dilution ເຈືອຈາງຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງສໍາລັບ 30 ນາທີ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຈຸລັງໄດ້ຖືກລ້າງ 3 ເທື່ອດ້ວຍ PBST ແລະຕ້ານກັບ DAPI (Thermo, #D1306) ໃນ PBS ສໍາລັບ 10 ນາທີໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.ຫຼັງຈາກ 3 ລ້າງດ້ວຍ PBS, ຈຸລັງໄດ້ຖືກຜະນຶກເຂົ້າກັນໃນ 50% glycerol (Sangon, #A600232) ໃນ PBS ສໍາລັບການຖ່າຍຮູບ.ຮູບພາບ Immunofluorescent ແມ່ນໄດ້ຮັບໂດຍໃຊ້ກ້ອງຈຸລະທັດມຸມໂຄ້ງ ZEISS LSM 900 Airyscan2 ແລະຊອບແວ ZNE 3.5.
ສໍາລັບການຖ່າຍຮູບ fluorescent ອົກຊີເຈນແບບ singlet, ຈຸລັງຖືກລ້າງສອງຄັ້ງດ້ວຍ Hanks HEPES buffer ກ່ອນທີ່ຈະເພີ່ມ 100 nM Si-DMA ໃນ Hanks HEPES buffer (DOJINDO, #MT05).ຫຼັງ​ຈາກ​ການ​ສໍາ​ຜັດ​ກັບ​ແສງ​ສະ​ຫວ່າງ​, ຈຸ​ລັງ​ໄດ້​ຮັບ​ການ incubator ໃນ CO2 incubator ທີ່ 37 ° C ສໍາ​ລັບ 45 ນາ​ທີ​.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຈຸລັງໄດ້ຖືກລ້າງສອງຄັ້ງດ້ວຍ HEPES buffer ຂອງ Hanks ແລະຕ້ານກັບ Hoechst ໃນ Hanks 'HEPES buffer ເປັນເວລາ 10 ນາທີໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງແລະສະແດງພາບໂດຍໃຊ້ກ້ອງຈຸລະທັດ ZEISS LSM 900 confocal., #M36008) ໃນ HBSS buffer ປະກອບດ້ວຍທາດການຊຽມແລະ magnesium.ຫຼັງຈາກການສໍາຜັດກັບແສງຫຼື doxorubicin (MCE, #HY-15142A), ຈຸລັງໄດ້ຖືກນໍາໄປອົບໃນຕູ້ອົບ CO2 ຢູ່ທີ່ 37 ° C. ສໍາລັບ 10 ນາທີ, ລ້າງສອງຄັ້ງດ້ວຍ Buffer HBSS, ແລະ incubated ດ້ວຍ Hoechst ໃນ HBSS buffer ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.ນາທີ.Doxorubicin ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນການຄວບຄຸມການສືບສວນໃນທາງບວກທີ່ຈຸລັງໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ 20 μM doxorubicin ໃນ HBSS ທີ່ມີ 1% BSA ສໍາລັບ 30 ນາທີ.ຮູບພາບ Immunofluorescent ໄດ້ຮັບໂດຍໃຊ້ກ້ອງຈຸລະທັດ Zeiss LSM 900 confocal.
ຈຸລັງ HEK293T ສະແດງອອກຢ່າງໝັ້ນທ່ຽງ mito-miniSOG ໄດ້ຖືກແກ່ນດ້ວຍຄວາມໜາແໜ້ນປະມານ 30% ໃນຖ້ວຍ 15 ຊມ.ຫຼັງຈາກ 48 ຊົ່ວໂມງ, ເມື່ອເຖິງ 80% confluence, ຈຸລັງໄດ້ຖືກລ້າງຫນຶ່ງຄັ້ງດ້ວຍ PBS, incubed ກັບ 1 mM Probe 3 ໃນ buffer HBSS ສົດໃນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງທີ່ 37 ° C ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນເຮັດໃຫ້ມີແສງດ້ວຍ LED ສີຟ້າເປັນເວລາ 10 ນາທີຢູ່ໃນຫ້ອງ. ອຸນ​ຫະ​ພູມ..ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຈຸລັງໄດ້ຖືກລ້າງສອງຄັ້ງດ້ວຍ PBS, ຂູດແລະຖືກລະງັບຄືນໃນ buffer PBS ເຢັນທີ່ມີ EDTA-free protease inhibitors (MCE, #HY-K0011).ຈຸລັງໄດ້ຖືກ lysed ໂດຍ sonicating ປາຍສໍາລັບ 1 ນາທີ (1 ວິນາທີສຸດແລະ 1 ວິນາທີ off ຢູ່ທີ່ 35% ຄວາມກວ້າງໄກ).ການປະສົມຜົນໄດ້ຮັບໄດ້ຖືກຈຸດສູນກາງທີ່ 15,871 xg ເປັນເວລາ 10 ນາທີຢູ່ທີ່ 4 ° C ເພື່ອເອົາສິ່ງເສດເຫຼືອ, ແລະຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ supernatant ໄດ້ຖືກປັບເປັນ 4 mg/mL ໂດຍໃຊ້ຊຸດທົດສອບທາດໂປຼຕີນຈາກ BCA (Beyotime, #P0009).ສົມທົບ 1 ml ຂອງ lysate ຂ້າງເທິງກັບ 0.1 mM photodegradable biotin azide (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA ligand (Aladdin, #T162437), ແລະ 1 mM CuSO4 incub ລຸ່ມ. ພືດຫມູນວຽນເຖິງ 1 ຊົ່ວໂມງໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.ຫຼັງ​ຈາກ​ການ​ຕິ​ກິ​ຣິ​ຍາ snap​, ເພີ່ມ​ປະ​ສົມ​ກັບ​ການ​ແກ້​ໄຂ​ທາງ​ສ່ວນ​ຫນ້າ​ຂອງ​ການ​ປະ​ສົມ (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) ໃນ vial ແກ້ວ 10 ml.ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກປະສົມແລະ centrifuged ຢູ່ທີ່ 4500 g ສໍາລັບ 10 ນາທີຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.ການແກ້ໄຂຕ່ໍາແລະເທິງໄດ້ຖືກຍົກເລີກ, precipitate ໄດ້ຖືກລ້າງສອງຄັ້ງດ້ວຍ 1 ml ຂອງ methanol ແລະ centrifuged ທີ່ 15871 × g ສໍາລັບ 5 ນາທີຢູ່ທີ່ 4 ° C.ຕື່ມ 1 ml ຂອງ 8 M urea (Aladdin, no. U111902) ໃນ 25 mM ammonium bicarbonate (ABC, Aladdin, no. A110539) ເພື່ອລະລາຍ precipitate ໄດ້.ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກສ້າງໃຫມ່ດ້ວຍ 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 ໃນ 25 mM ABC) ສໍາລັບ 40 ນາທີທີ່ 55 ° C, ປະຕິບັດຕາມດ້ວຍການເພີ່ມ 15 mM iodoacetamide ສົດ (Sangon, #A600539) ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງໃນຄວາມມືດ.Alkylation ພາຍໃນ 30 ນາທີ..ມີການເພີ່ມ 5 mM dithiothreitol ເພື່ອຢຸດຕິກິຣິຍາ.ກະກຽມປະມານ 100 µl NeutrAvidin agarose beads (Thermo, #29202) ສໍາລັບແຕ່ລະຕົວຢ່າງໂດຍການລ້າງ 3 ເທື່ອດ້ວຍ 1 ml PBS.ການແກ້ໄຂ proteome ຂ້າງເທິງນີ້ໄດ້ຖືກເຈືອຈາງດ້ວຍ 5 ມລ PBS ແລະ incubated ດ້ວຍ beads NeutrAvidin agarose ກ່ອນລ້າງສໍາລັບ 4 ຊົ່ວໂມງໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ລູກປັດໄດ້ຖືກລ້າງ 3 ເທື່ອດ້ວຍ 5 ມລ PBS ທີ່ມີ 0.2% SDS (Sangon, #A600485), 3 ເທື່ອກັບ 5 ມລ PBS ທີ່ມີ 1M urea, ແລະ 3 ເທື່ອດ້ວຍ 5 ml ddH2O.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, beads ໄດ້ຖືກຂຸດຄົ້ນໂດຍການ centrifugation ແລະ resuspended ໃນ 200 μlຂອງ 25 mM ABC ທີ່ປະກອບດ້ວຍ 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) ແລະ 20 ng/μl trypsin (Promega, #V5280).ພະຍາຍາມpsinize ຄ້າງຄືນຢູ່ທີ່ 37°C ດ້ວຍການຫມຸນ.ປະຕິກິລິຍາໄດ້ຖືກຢຸດເຊົາໂດຍການເພີ່ມອາຊິດ formic (Thermo, # A117-50) ຈົນກ່ວາ pH ບັນລຸ 2-3.ລູກປັດໄດ້ຖືກລ້າງ 3 ເທື່ອດ້ວຍ 1 ມລຂອງ PBS ທີ່ມີ 0.2% SDS, 3 ເທື່ອກັບ 1 ມລຂອງ PBS ທີ່ມີ 1 M urea, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນ 3 ເທື່ອດ້ວຍນ້ໍາກັ່ນ 1 ml.peptides ທີ່ຖືກດັດແປງໄດ້ຖືກປ່ອຍອອກມາໂດຍ lysis ແສງສະຫວ່າງ (365 nm) ສໍາລັບ 90 min ໂດຍໃຊ້ 200 μlຂອງ 70% MeOH.ຫຼັງຈາກ centrifugation, supernatant ໄດ້ຖືກເກັບກໍາ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ລູກປັດໄດ້ຖືກລ້າງຫນຶ່ງຄັ້ງດ້ວຍ 100 μlຂອງ 70% MeOH ແລະ supernatants ໄດ້ຖືກລວບລວມ.ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກຕາກໃຫ້ແຫ້ງໃນເຄື່ອງສຸມສູນຍາກາດ Speedvac ແລະເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -20 ° C ຈົນກ່ວາການວິເຄາະ.
ເພື່ອກໍານົດແລະປະລິມານ peptides singlet oxygen modified, ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກແກ້ໄຂຄືນໃນ 0.1% ອາຊິດ formic ແລະ 1 μgຂອງ peptides ໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer ທີ່ຕິດຕັ້ງດ້ວຍແຫຼ່ງ nano ESI ຈາກ Tune ແລະ Xcalibur ຈາກຊອບແວຜູ້ຂາຍ 4.3.ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກແຍກຢູ່ໃນຖັນ capillary ບັນຈຸພາຍໃນ 75 µm × 15 cm ດ້ວຍວັດສະດຸ 3 µm C18 (ReproSil-pur, #r13.b9.) ແລະເຊື່ອມຕໍ່ກັບລະບົບ EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).peptides ໄດ້ຖືກແຍກອອກໂດຍ linear 95 ນາທີ gradient chromatography ຈາກ 8% solvent B ກັບ 50% solvent B (A = 0.1% ອາຊິດ formic ໃນນ້ໍາ, B = 0.1% ອາຊິດ formic ໃນ 80% acetonitrile), ຫຼັງຈາກນັ້ນ linearly ເພີ່ມຂຶ້ນເປັນ 98% B min ໃນ 6 ນາທີທີ່ອັດຕາການໄຫຼຂອງ 300 nl / ນາທີ.Orbitrap Fusion Lumos ເກັບກໍາຂໍ້ມູນສະລັບກັນລະຫວ່າງການສະແກນ MS ເຕັມແລະການສະແກນ MS2 ຂຶ້ນກັບຂໍ້ມູນ.ແຮງດັນຂອງ sputtering ໄດ້ຖືກກໍານົດເປັນ 2.1 kV ແລະອຸນຫະພູມຂອງ capillary ການຂົນສົ່ງ ion ແມ່ນ 320 ° C.MS spectra (350-2000 m/z) ຖືກເກັບລວບລວມດ້ວຍຄວາມລະອຽດ 120,000, AGC 4 × 105, ແລະເວລາປ້ອນຂໍ້ມູນສູງສຸດ 150 ms.10 ຕົວຕັ້ງຕົວຕີທີ່ຄິດຄ່າຄູນທົ່ວໄປທີ່ສຸດໃນແຕ່ລະສະແກນເຕັມໄດ້ຖືກແບ່ງແຍກໂດຍໃຊ້ HCD ທີ່ມີພະລັງງານການຂັດກັນປົກກະຕິຂອງ 30%, ປ່ອງຢ້ຽມແຍກສີ່ຫລ່ຽມຂອງ 1.6 m/z, ແລະການຕັ້ງຄ່າຄວາມລະອຽດ 30,000.ເປົ້າໝາຍ AGC ສໍາລັບ tandem mass spectrometry ໂດຍໃຊ້ 5×104 ແລະເວລາປ້ອນຂໍ້ມູນສູງສຸດ 150 ms.ການຍົກເວັ້ນແບບເຄື່ອນໄຫວແມ່ນຕັ້ງເປັນ 30 ວິນາທີ. ໄອອອນທີ່ບໍ່ໄດ້ມອບໝາຍ ຫຼືຜູ້ທີ່ມີຄ່າບໍລິການ 1+ ແລະ >7+ ຖືກປະຕິເສດສຳລັບ MS/MS. ໄອອອນທີ່ບໍ່ໄດ້ມອບໝາຍ ຫຼືຜູ້ທີ່ມີຄ່າບໍລິການ 1+ ແລະ >7+ ຖືກປະຕິເສດສຳລັບ MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. ion ຫຼື ion ທີ່ບໍ່ໄດ້ມອບໝາຍດ້ວຍຄ່າ 1+ ແລະ >7+ ຖືກປະຕິເສດສຳລັບ MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. ion ຫຼື ion ທີ່ບໍ່ລະບຸທີ່ມີຄ່າບໍລິການ 1+ ແລະ >7+ ຖືກປະຕິເສດສຳລັບ MS/MS.
ຂໍ້ມູນດິບຖືກປະມວນຜົນໂດຍໃຊ້ເວທີຄອມພິວເຕີ້ FragPipe ໂດຍອີງໃສ່ MSFragger.ຄວາມລໍາອຽງຂອງມະຫາຊົນແລະອາຊິດ amino ທີ່ສອດຄ້ອງກັນໄດ້ຖືກກໍານົດໂດຍໃຊ້ວິທີການຄົ້ນຫາແບບເປີດທີ່ມີຄວາມທົນທານຕໍ່ມະຫາຊົນຂອງ -150 ຫາ 500 Da.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, peptides ທີ່ຖືກດັດແປງໄດ້ຖືກລະບຸໂດຍໃຊ້ການດັດແປງ histidine ທີ່ມີການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງມະຫາຊົນຂອງ +229.0964 ແລະ +247.1069 Da ໃນ PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
ຈຸລັງທີ່ສະແດງອອກຢ່າງໝັ້ນທ່ຽງຂອງ gene miniSOG ທີ່ຖືກປະສົມໄດ້ຖືກໃສ່ໃນຖ້ວຍ 6 ຊມ.ເມື່ອເຖິງຈຸດເຊື່ອມຕໍ່ປະມານ 80%, ຈຸລັງໄດ້ຖືກລ້າງຫນຶ່ງຄັ້ງດ້ວຍ HBSS (Gibco, #14025092), ຫຼັງຈາກນັ້ນ incubated ກັບ probes ສານເຄມີໃນ HBSS ສໍາລັບ 1 ຊົ່ວໂມງຢູ່ທີ່ 37 ° C ແລະເຮັດໃຫ້ມີແສງສີຟ້າ.10W LED ສໍາລັບ 20 ນາທີຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.ເພື່ອກໍານົດຊະນິດຂອງຊະນິດອົກຊີເຈນທີ່ມີປະຕິກິລິຍາທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ PDPL, 0.5 mM ວິຕາມິນ C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM mannitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 ໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໃນຈຸລັງເປັນອາຫານເສີມ.ຫຼັງຈາກລ້າງດ້ວຍ PBS ເຢັນ, ຈຸລັງໄດ້ຖືກຂູດ, ເກັບກໍາຢູ່ໃນທໍ່ centrifuge 1.5 ml, ແລະ sonicated ກັບປາຍສໍາລັບ 1 min ໃນ 200 μlຂອງ PBS ກັບ 1x protease inhibitor ໂດຍບໍ່ມີ EDTA (1 s ແລະ 1 s ໂດຍບໍ່ມີ, ຄວາມກວ້າງໃຫຍ່ໄພສານ 35%).ການປະສົມຜົນໄດ້ຮັບໄດ້ຖືກຈຸດສູນກາງທີ່ 15,871 × g ສໍາລັບ 10 ນາທີຢູ່ທີ່ 4 ° C ແລະຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ supernatant ໄດ້ຖືກປັບເປັນ 1 mg / mL ໂດຍໃຊ້ຊຸດທົດສອບທາດໂປຼຕີນຈາກ BCA.ປະມານ 50 µl ຂອງ lysate ຂ້າງເທິງໄດ້ຖືກອົບດ້ວຍ 0.1 mM rhodamine azide (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, ແລະ 1 mM CuSO4 ເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງດ້ວຍການຫມຸນຈາກລຸ່ມຂຶ້ນເທິງ.ຫຼັງຈາກຕິກິຣິຍາຄລິກ, ຝົນທີ່ມີ acetone ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍການເພີ່ມ 250 μlຂອງ acetone ກ່ອນແຊ່ເຢັນໃສ່ຕົວຢ່າງ, incubating ຢູ່ທີ່ -20 ° C ສໍາລັບ 20 ນາທີແລະ centrifuging ທີ່ 6010 × g ສໍາລັບ 10 ນາທີທີ່ 4 ° C.ເກັບເມັດແລ້ວຕົ້ມໃນ 50 µl ຂອງ 1x Laemmli's buffer ສໍາລັບ 10 min at 95 °C.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກວິເຄາະຢູ່ໃນ gels ຍາວ SDS-PAGE ແລະສະແດງພາບໂດຍໃຊ້ລະບົບຮູບພາບ Bio-rad ChemiDoc MP Touch ກັບຊອບແວ Image Lab Touch.
ການສະແດງອອກແລະການຊໍາລະລ້າງຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ recombinant miniSOG-6xHis ໄດ້ຖືກປະຕິບັດຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນຫນ້ານີ້.ໂດຍຫຍໍ້, ຈຸລັງ E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) ຖືກປ່ຽນດ້ວຍ pET21a-miniSOG-6xHis ແລະການສະແດງອອກຂອງທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກກະຕຸ້ນດ້ວຍ 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168).ຫຼັງຈາກ lysis ຈຸລັງ, ທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກຊໍາລະໂດຍນໍາໃຊ້ລູກປັດ Ni-NTA agarose (MCE, no. 70666), dialyzed ກັບ PBS, ແລະເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -80 ° C.
ສໍາລັບການວິເຄາະພູມຕ້ານທານຂອງປ້າຍກໍາກັບ vitro, ປະສົມ 100 μM purified miniSOG, 1 mM probe 3, ແລະ 1 μg anti-label mouse monoclonal antibody (TransGen, #HT501-01) ໃນ PBS ກັບປະລິມານຕິກິຣິຍາທັງຫມົດ 50 μl..ການປະສົມປະຕິກິລິຍາໄດ້ຖືກ irradiated ດ້ວຍໄຟ LED ສີຟ້າສໍາລັບ 0, 2, 5, 10, ແລະ 20 ນາທີຢູ່ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງ.ປະສົມໄດ້ຖືກອົບດ້ວຍ 0.1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, ແລະ 1 mM CuSO4 ສໍາລັບ 1 ຊົ່ວໂມງໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງໃນເຄື່ອງສັ່ນສະເທືອນການເຄື່ອນໄຫວຂຶ້ນ.ຫຼັງຈາກປະຕິກິລິຍາ snap, ເພີ່ມ 4x Laemmli buffer ໂດຍກົງໃສ່ສ່ວນປະສົມແລະຕົ້ມທີ່ 95 ° C ສໍາລັບ 10 ນາທີ.ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກວິເຄາະໃນ SDS-PAGE gels ແລະວິເຄາະໂດຍການ blotting ຕາເວັນຕົກດ້ວຍ streptavidin-HRP (1: 1000, Solarbio, #SE068).
peptide ສັງເຄາະທີ່ມີ histidine ກັບ C-terminal amidation (LHDALDAK-CONH2) ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອວິເຄາະການຕິດສະຫຼາກ peptide ທີ່ຢູ່ໃກ້ຄຽງໃນ vitro.ໃນການວິເຄາະນີ້, 100 μM purified miniSOG, 10 mM probe 3 ແລະ 2 μg / ml peptide ສັງເຄາະໄດ້ຖືກປະສົມໃນ PBS ໃນປະລິມານຕິກິຣິຍາທັງຫມົດ 50 μl.ປະສົມປະຕິກິລິຍາໄດ້ຖືກ irradiated ດ້ວຍໄຟ LED ສີຟ້າເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.ຕົວຢ່າງໜຶ່ງຈຸລິນຊີໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ລະບົບ LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight mass spectrometer ດ້ວຍຊອບແວການວິເຄາະ MassLynx).
ຈຸລັງ HEK293T ສະແດງອອກຢ່າງໝັ້ນທ່ຽງຂອງ gene fusion miniSOG ໄດ້ຖືກແກ່ນໃນຖ້ວຍ 10 ຊຕມສໍາລັບສາຍທີ່ມີ organelle localization ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (Mito, ER, Nucleus) ແລະຖ້ວຍ 15 cm ສໍາລັບສາຍ Parkin-miniSOG ແລະ BRD4-miniSOG.ເມື່ອເຖິງຈຸດເຊື່ອມຕໍ່ ~ 90%, ຈຸລັງໄດ້ຖືກລ້າງຫນຶ່ງຄັ້ງດ້ວຍ HBSS, ຫຼັງຈາກນັ້ນ incubated ກັບ probe 3 ໃນ HBSS ສໍາລັບ 1 ຊົ່ວໂມງທີ່ 37 ° C ແລະ illuminated ດ້ວຍ 10 W ສີຟ້າ LED ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.ສໍາລັບການຕິດສະຫຼາກທີ່ບໍ່ມີການຕິດຕໍ່ຂອງ Parkin, 10 µM proton carbonyl cyanide carrier m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) ກັບ probe 3 ໃນ HBSS ໄດ້ຖືກເພີ່ມສໍາລັບ 1 ຊົ່ວໂມງທີ່ 37 ° C.The cell lysis, click chemistry, reduction and alkylation ຂັ້ນ​ຕອນ​ແມ່ນ​ຄື​ກັນ​ກັບ​ການ​ອະ​ທິ​ບາຍ​ຂ້າງ​ເທິງ​, ຍົກ​ເວັ້ນ 2 mg ຂອງ lysate ໄດ້​ຖືກ​ເພີ່ມ​ແລະ biotin PEG3 azide ໄດ້​ຖືກ​ນໍາ​ໃຊ້​ໃນ​ຕິ​ກິ​ຣິ​ຍາ​ຄລິກ​ແທນ​ທີ່​ຈະ photodegradable biotin azide​.ຫຼັງຈາກການເສີມສ້າງ, ລູກປັດໄດ້ຖືກລ້າງ 3 ເທື່ອດ້ວຍ 5 ມລຂອງ PBS ທີ່ມີ 0.2% SDS, 3 ເທື່ອກັບ 5 ມລຂອງ PBS ທີ່ມີ 1 M urea, ແລະ 3 ເທື່ອກັບ 5 ມລຂອງ PBS.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, trypsin 2 µg ຖືກເພີ່ມໃສ່ 300 µl 25 mM ABC ບັນຈຸ 1 M urea ເພື່ອແຍກທາດໂປຼຕີນໃນຄືນທີ່ 37 ° C.ປະຕິກິລິຍາຖືກຢຸດໂດຍການເພີ່ມອາຊິດ formic ຈົນກ່ວາ pH ຂອງ 2-3 ໄດ້ບັນລຸ.ຫຼັງຈາກ trypsinization ເທິງລູກປັດ, ການແກ້ໄຂ peptide ໄດ້ຖືກທໍາລາຍໂດຍໃຊ້ຖັນ SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) ແລະຕາກໃຫ້ແຫ້ງໃນສູນຍາກາດ Speedvac.Peptides ໄດ້ຖືກລະລາຍຄືນໃນ 0.1% ອາຊິດ formic ແລະ 500 ng ຂອງ peptides ໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer ທີ່ຕິດຕັ້ງດ້ວຍແຫຼ່ງ nano-ESI ທີ່ອະທິບາຍຂ້າງເທິງ.Peptides ໄດ້ຖືກແຍກອອກຈາກທາງການຄ້າ precolumns RP-HPLC (75 μm x 2 cm) (Thermo, ສະບັບເລກທີ 164946) ແລະຖັນ RP-HPLC ການວິເຄາະ (75 μm x 25 cm) (Thermo, ສະບັບເລກທີ 164941), ທັງສອງເຕັມໄປດ້ວຍ 2 μm.gradient ຈາກ 8% ຫາ 35% ACN ໃນ 60 ນາທີ, ຫຼັງຈາກນັ້ນເພີ່ມຂຶ້ນເປັນເສັ້ນເປັນ 98% B ໃນ 6 ນາທີທີ່ອັດຕາການໄຫຼຂອງ 300 Nl / ນາທີ.MS spectra (350-1500 m/z) ຖືກລວບລວມດ້ວຍຄວາມລະອຽດ 60,000, AGC 4 × 105, ແລະເວລາປ້ອນຂໍ້ມູນສູງສຸດ 50 ms.ion ທີ່ຖືກຄັດເລືອກໄດ້ຖືກແບ່ງອອກຕາມລໍາດັບໂດຍ HCD ໃນຮອບວຽນ 3 s ດ້ວຍພະລັງງານການຂັດກັນແບບປົກກະຕິຂອງ 30%, ປ່ອງຢ້ຽມແຍກ quadrupole ຂອງ 1.6 m/z, ແລະຄວາມລະອຽດຂອງ 15000. A 5 × 104 tandem spectrometer AGC ເປົ້າຫມາຍແລະເວລາສີດສູງສຸດ. ຂອງ 22 ms ໄດ້​ຖືກ​ນໍາ​ໃຊ້​.ການຍົກເວັ້ນແບບເຄື່ອນໄຫວແມ່ນຕັ້ງເປັນ 45 ວິນາທີ. ໄອອອນທີ່ບໍ່ໄດ້ມອບໝາຍ ຫຼືຜູ້ທີ່ມີຄ່າບໍລິການ 1+ ແລະ >7+ ຖືກປະຕິເສດສຳລັບ MS/MS. ໄອອອນທີ່ບໍ່ໄດ້ມອບໝາຍ ຫຼືຜູ້ທີ່ມີຄ່າບໍລິການ 1+ ແລະ >7+ ຖືກປະຕິເສດສຳລັບ MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. ion ຫຼື ion ທີ່ບໍ່ໄດ້ມອບໝາຍດ້ວຍຄ່າ 1+ ແລະ >7+ ຖືກປະຕິເສດສຳລັບ MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. ion ຫຼື ion ທີ່ບໍ່ລະບຸທີ່ມີຄ່າບໍລິການ 1+ ແລະ >7+ ຖືກປະຕິເສດສຳລັບ MS/MS.
ຂັ້ນຕອນການກະກຽມຕົວຢ່າງເຖິງການເສີມສ້າງຂອງລູກປັດ NeutrAvidin ແມ່ນຄືກັນກັບໃນການວິເຄາະ LC-MS / MS ທີ່ອະທິບາຍຂ້າງເທິງ.ປະມານ 50 μgຂອງ lysate ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນວັດສະດຸປ້ອນສໍາລັບການຄວບຄຸມການໂຫຼດແລະ 2 mg ຂອງ lysate ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບປະຕິກິລິຍາຄລິກ.ຫຼັງຈາກການເສີມສ້າງແລະການລ້າງດ້ວຍ neutravidin, ທາດໂປຼຕີນທີ່ຖືກຜູກມັດໄດ້ຖືກ eluted ໂດຍການເພີ່ມ 50 μlຂອງ buffer Laemmli ເຂົ້າໄປໃນ beads ຢາງ agarose ແລະຕົ້ມຢູ່ທີ່ 95 ° C. ສໍາລັບ 5 ນາທີ.ການຄວບຄຸມການປ້ອນຂໍ້ມູນການໂຫຼດ ແລະຕົວຢ່າງທີ່ອຸດົມດ້ວຍລູກປັດໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍ SDS-PAGE ແລະໂອນໄປໃສ່ເຍື່ອ PVDF (Millipore, #ISEQ00010) ໂດຍວິທີການ blot ຕາເວັນຕົກມາດຕະຖານ.ເຍື່ອໄດ້ຖືກສະກັດດ້ວຍນົມ skim 5% (Sangon, #A600669) ໃນ TBS ທີ່ມີ 0.1% tween-20 (TBST) ແລະ incubated ຕາມລໍາດັບດ້ວຍພູມຕ້ານທານປະຖົມແລະມັດທະຍົມ.ພູມຕ້ານທານຂັ້ນຕົ້ນໄດ້ຖືກເຈືອຈາງ 1:1000 ໃນນົມ 5% ໃນ TBST ແລະ incubated ຄືນທີ່ 4 ° C.ພູມຕ້ານທານຂັ້ນສອງໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ໃນອັດຕາສ່ວນຂອງ 1: 5000 ແລະ incubated ສໍາລັບ 1 ຊົ່ວໂມງຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.ເຍື່ອໄດ້ຖືກເບິ່ງເຫັນໂດຍ chemiluminescence ໂດຍໃຊ້ລະບົບຮູບພາບ Chemidoc MP.ການສະແກນທີ່ບໍ່ໄດ້ຕັດທັງໝົດຂອງ blots ແລະ gels ໃນຮູບໄດ້ຖືກນໍາສະເຫນີເປັນຂໍ້ມູນດິບ.
ພູມຕ້ານທານຂັ້ນຕົ້ນທີ່ໃຊ້ໃນການສຶກສານີ້ລວມມີ ພູມຕ້ານທານຂອງ rabbit anti-SFPQ monoclonal antibody (CST, no. 71992), rabbit anti-FUS monoclonal antibody (CST, no. 67840), rabbit anti-NSUN2 polyclonal antibody (Proteintech, no. 20854-1- AP), rabbit anti-mSin3A polyclonal antibody (Abcam, #ab3479), mouse anti-tag monoclonal antibody (TransGen, #HT201-02), mouse anti-β-actin monoclonal antibody (TransGen, #HC201-01), ຕ້ານ rabbit -CDK2 monoclonal antibody (ABclonal, #A0094), rabbit monoclonal antibody ເຖິງ CTBP1 (ABclonal, #A11600), rabbit polyclonal antibody ກັບ DUT (ABclonal, #A2901), rabbit polyclonal antibody ກັບ PSMC4 (ABclonal, #A2505), ຕ້ານ rabbit DNAJB1 ພູມຕ້ານທານ polyclonal (ABclonal, # A5504).ພູມຕ້ານທານເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ຢູ່ທີ່ການເຈືອຈາງ 1:1000 ໃນນົມ 5% skim ໃນ TBST.ພູມຕ້ານທານຂັ້ນສອງທີ່ໃຊ້ໃນການສຶກສານີ້ລວມມີສານຕ້ານອະນຸມູນອິດສະລະ IgG (TransGen, #HS101-01), ຕ້ານຫນູ IgG (TransGen, #HS201-01) ຢູ່ທີ່ການເຈືອຈາງ 1: 5000.
ເພື່ອສືບສວນຕື່ມອີກວ່າ BRD4 ມີປະຕິກິລິຍາກັບ SFPQ ຫຼືບໍ່, ເຊັລ HEK293T ແລະ BRD4-miniSOG ຄົງທີ່ທີ່ສະແດງ HEK293T ຫຼາຍເກີນໄປໄດ້ຖືກໃສ່ໃນຖ້ວຍ 10 ຊມ.ເຊລຖືກລ້າງດ້ວຍ PBS ເຢັນ ແລະ lysed ໃນ 1 ml Pierce IP lysis buffer (Thermo Fisher, #87787) ດ້ວຍ EDTA-free protease inhibitor ສໍາລັບ 30 ນາທີທີ່ 4 ° C.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, lysates ໄດ້ຖືກລວບລວມໃນທໍ່ centrifuge 1.5 ml ແລະ centrifuged ທີ່ 15,871 xg ສໍາລັບ 10 ນາທີທີ່ 4 ° C.supernatant ໄດ້ຖືກເກັບກ່ຽວ ແລະ incubated ດ້ວຍ 5 µg ຂອງ anti-V5 anti-V5 antibody monoclonal antibody (CST, #80076) ໃນຄືນທີ່ 4 ° C.ລ້າງປະມານ 50 µl ຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກແມ່ເຫຼັກ A/G (MCE, #HY-K0202) ສອງຄັ້ງດ້ວຍ PBS ທີ່ມີ 0.5% Tween-20.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຈຸລັງ lysates ໄດ້ຖືກອົບດ້ວຍລູກປັດແມ່ເຫຼັກເປັນເວລາ 4 ຊົ່ວໂມງຢູ່ທີ່ 4 ° C ດ້ວຍການຫມຸນຈາກລຸ່ມຫາເທິງ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ລູກປັດໄດ້ຖືກລ້າງສີ່ຄັ້ງດ້ວຍ 1 ml ຂອງ PBST buffer ແລະຕົ້ມຢູ່ທີ່ 95 ° C ສໍາລັບ 5 ນາທີ.ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກວິເຄາະຢູ່ໃນ SDS-PAGE gels ແລະໂອນໄປຫາເຍື່ອ PVDF ໂດຍໃຊ້ວິທີການ blot ມາດຕະຖານຕາເວັນຕົກ.ເຍື່ອໄດ້ຖືກສະກັດຢູ່ໃນນົມ skim 5% ໃນ TBST ແລະ incubated ຕາມລໍາດັບດ້ວຍພູມຕ້ານທານປະຖົມແລະມັດທະຍົມ.Primary Antibody Rabbit anti-SFPQ monoclonal antibody (CST, #71992) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ໃນອັດຕາສ່ວນຂອງ 1: 1000 ໃນນົມ 5% skim ໃນ TBST ແລະ incubated ຄືນທີ່ 4 ° C.Anti-rabbit IgG ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ໃນອັດຕາສ່ວນຂອງ 1: 5000 ແລະ incubated ສໍາລັບ 1 ຊົ່ວໂມງຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.ເຍື່ອໄດ້ຖືກເບິ່ງເຫັນໂດຍ chemiluminescence ໂດຍໃຊ້ລະບົບຮູບພາບ Chemidoc MP.
ໂຄງສ້າງທັງໝົດທີ່ໃຊ້ສໍາລັບການວິເຄາະພື້ນທີ່ເຂົ້າເຖິງໄດ້ຂອງ Solvent (SASA) ແມ່ນໄດ້ມາຈາກ Protein Data Bank (PDB)52 ຫຼື AlphaFold Protein Structure Database53.SASA ຢ່າງແທ້ຈິງຖືກຄິດໄລ່ສໍາລັບແຕ່ລະ residue ໂດຍໃຊ້ໂຄງການ FreeSASA.ພຽງແຕ່ຂໍ້ມູນ SASA ທີ່ຄົບຖ້ວນແລະບໍ່ຊັດເຈນສໍາລັບ histidine ທີ່ຕິດສະຫລາກແລະປະເທດເພື່ອນບ້ານໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ SASA ສະເລ່ຍສໍາລັບແຕ່ລະໂຄງສ້າງ.ຄວາມສາມາດໃນການເຂົ້າເຖິງຂອງສານລະລາຍທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ (RSA) ສໍາລັບແຕ່ລະ histidine ໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍການແບ່ງຄ່າ SASA ຢ່າງແທ້ຈິງໂດຍພື້ນທີ່ຂອງ residue ສູງສຸດ empirical ທີ່ເປັນໄປໄດ້ທີ່ມີຢູ່ໃນຕົວລະລາຍ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, histidines ທັງຫມົດໄດ້ຖືກຈັດປະເພດເປັນເຊື່ອງໄວ້ຖ້າຫາກວ່າ RSA ສະເລ່ຍແມ່ນຕ່ໍາກວ່າ 20%, ຖ້າບໍ່ດັ່ງນັ້ນ exposed56.
ໄຟລ໌ດິບທີ່ໄດ້ຮັບໃນໂຫມດ DDA ໄດ້ຖືກຄົ້ນຫາໂດຍໃຊ້ Proteome Discoverer (v2.5) ຫຼື MSfragger (Fragpipe v15.0) ໃນຖານຂໍ້ມູນໂປຣຕີນທີ່ຜ່ານການກວດກາຂອງ SwissProt ທີ່ເຫມາະສົມທີ່ມີສານປົນເປື້ອນທົ່ວໄປ.peptides ຕ້ອງການ trypsin ຄົບຖ້ວນສົມບູນກັບສອງສະຖານທີ່ cleavage ທີ່ຂາດຫາຍໄປ, carbamoyl methylation ເປັນການແກ້ໄຂຄົງທີ່ແລະ methionine oxidation ເປັນການປ່ຽນແປງແບບເຄື່ອນໄຫວ.ຄວາມທົນທານຕໍ່ນໍ້າໜັກຄາຣະວາ ແລະຊິ້ນສ່ວນຖືກຕັ້ງເປັນ 10 ppm ແລະ 0.02 Da (MS2 Orbitrap), ຕາມລໍາດັບ. ການຕີສິ່ງປົນເປື້ອນໄດ້ຖືກໂຍກຍ້າຍອອກ, ແລະທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກກັ່ນຕອງເພື່ອໃຫ້ໄດ້ອັດຕາການຄົ້ນພົບທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ <1%. ການຕີສິ່ງປົນເປື້ອນໄດ້ຖືກໂຍກຍ້າຍອອກ, ແລະທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກກັ່ນຕອງເພື່ອໃຫ້ໄດ້ອັດຕາການຄົ້ນພົບທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфафициент < ложножно %. ມົນລະພິດ hits ໄດ້ຖືກໂຍກຍ້າຍອອກແລະທາດໂປຼຕີນຈາກການກັ່ນຕອງເພື່ອໃຫ້ອັດຕາການກວດພົບທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງແມ່ນ <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных% обнина hits ປົນເປື້ອນໄດ້ຖືກໂຍກຍ້າຍອອກແລະທາດໂປຼຕີນຈາກການກັ່ນຕອງເພື່ອບັນລຸອັດຕາໃນທາງບວກທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງແມ່ນ <1%.ສໍາລັບການວິເຄາະດ້ານປະລິມານໂດຍບໍ່ມີການນໍາໃຊ້ປ້າຍຊື່, ເນື້ອໃນທາດໂປຼຕີນທີ່ປົກກະຕິຈາກສາມຄັ້ງທາງຊີວະພາບຖືກນໍາໃຊ້.ການວິເຄາະທ້ອງຖິ່ນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ subcellular ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ການວິເຄາະ Gene Ontology (GO) ຈາກ DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 ແລະຖານຂໍ້ມູນທີ່ລວບລວມແລະຈັດພີມມາໂດຍກຸ່ມ Alice Ting.ແຜນທີ່ພູເຂົາໄຟໄດ້ມາຈາກ Perseus (v1.6.15.0). ການປ່ຽນແປງຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກຄວາມອຸດົມສົມບູນຂອງທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກທົດສອບສໍາລັບຄວາມສໍາຄັນທາງສະຖິຕິໂດຍໃຊ້ t-test ສອງດ້ານ, ແລະການຕີທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກລະບຸວ່າມີການປ່ຽນແປງຄວາມອຸດົມສົມບູນ>2 (ເວັ້ນເສຍແຕ່ໄດ້ລະບຸໄວ້ເປັນຢ່າງອື່ນ) ແລະ p value <0.05. ການປ່ຽນແປງຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກຄວາມອຸດົມສົມບູນຂອງທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກທົດສອບສໍາລັບຄວາມສໍາຄັນທາງສະຖິຕິໂດຍໃຊ້ t-test ສອງດ້ານ, ແລະການຕີທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກລະບຸວ່າມີການປ່ຽນແປງຄວາມອຸດົມສົມບູນ>2 (ເວັ້ນເສຍແຕ່ໄດ້ລະບຸໄວ້ເປັນຢ່າງອື່ນ) ແລະ p value <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. ການປ່ຽນແປງຂອງເນື້ອໃນຂອງທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກທົດສອບສໍາລັບຄວາມສໍາຄັນທາງສະຖິຕິໂດຍໃຊ້ການທົດສອບ t-tailed ສອງຫາງ, ແລະການຈັບຄູ່ຂອງທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກກໍານົດໂດຍການປ່ຽນແປງເນື້ອຫາ >2 (ເວັ້ນເສຍແຕ່ໄດ້ບັນທຶກໄວ້ເປັນຢ່າງອື່ນ) ແລະຄ່າ ap <0.05.使用双边t 检验测试蛋白质丰度倍数变化的统计显着性，并确定蛋白质员咭的统计显着性，并确定蛋白质员中的并着匦。使用双边使用双边双边双边双边数说明说明和值值值值> <0.05. Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. ຄວາມສໍາຄັນທາງສະຖິຕິຂອງການປ່ຽນແປງຂອງເນື້ອໃນຂອງທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກທົດສອບໂດຍໃຊ້ການທົດສອບ t-tailed ສອງຫາງ, ແລະການຈັບຄູ່ຂອງທາດໂປຼຕີນແມ່ນຖືກກໍານົດສໍາລັບການປ່ຽນແປງເນື້ອໃນ>2 (ເວັ້ນເສຍແຕ່ໄດ້ລະບຸໄວ້ເປັນຢ່າງອື່ນ) ແລະ p-values ​​​​ <0.05.ການວິເຄາະປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ການວິເຄາະ GO ພ້ອມກັບຖານຂໍ້ມູນ String.
ການຈໍາລອງທາງຊີວະພາບສາມຄັ້ງໄດ້ຖືກປະຕິບັດດ້ວຍຜົນໄດ້ຮັບທີ່ຄ້າຍຄືກັນ.ການວິເຄາະທາງສະຖິຕິໄດ້ເຮັດດ້ວຍ GraphPad Prism (ຊອບແວ GraphPad) ແລະແຜນທີ່ພູເຂົາໄຟໄດ້ຖືກສ້າງຂຶ້ນດ້ວຍ Perseus (v1.6.15.0).ເພື່ອປຽບທຽບສອງກຸ່ມ, p-values ​​​​ໄດ້ຖືກກໍານົດໂດຍໃຊ້ t-test ຂອງນັກຮຽນສອງຫາງ.ພຽງແຕ່ທາດໂປຼຕີນຈາກ singleton ທີ່ໄດ້ລະບຸຢ່າງຫນ້ອຍສອງຄັ້ງໃນກຸ່ມທົດລອງໄດ້ຖືກລວມຢູ່ໃນພື້ນທີ່ຂອງພູເຂົາໄຟ, ແລະຄ່າທີ່ຂາດຫາຍໄປທີ່ສອດຄ້ອງກັນໃນກຸ່ມຄວບຄຸມໄດ້ຖືກແທນທີ່ດ້ວຍ Perseus ຈາກການແຈກຢາຍປົກກະຕິເພື່ອໃຫ້ p-value ສາມາດຖືກຄິດໄລ່.ແຖບຄວາມຜິດພາດເປັນຕົວແທນຂອງຄ່າສະເລ່ຍ ± ມາດຕະຖານ deviation.ໃນການວິເຄາະ proteomic ສໍາລັບການວິເຄາະສະຖິຕິ, ຄວາມອຸດົມສົມບູນຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ປາກົດຢູ່ໃນຢ່າງຫນ້ອຍສອງ replicates ຊີວະສາດໄດ້ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້.ວິທີການສະຖິຕິບໍ່ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກໍານົດຂະຫນາດຕົວຢ່າງລ່ວງຫນ້າ.ການທົດລອງບໍ່ແມ່ນແບບສຸ່ມ.ນັກຄົ້ນຄວ້າບໍ່ໄດ້ຕາບອດກັບວຽກງານໃນລະຫວ່າງການທົດລອງແລະການປະເມີນຜົນຂອງຜົນໄດ້ຮັບ.
ສໍາລັບຂໍ້ມູນເພີ່ມເຕີມກ່ຽວກັບການອອກແບບການສຶກສາ, ເບິ່ງບົດລາຍງານການຄົ້ນຄວ້າທໍາມະຊາດ abstract ເຊື່ອມຕໍ່ກັບບົດຄວາມນີ້.
ຂໍ້ມູນ spectrometry ມະຫາຊົນທີ່ໄດ້ຮັບໃນການສຶກສານີ້ໄດ້ຖືກສົ່ງໃຫ້ ProteomeXchange Consortium ຜ່ານບ່ອນເກັບຂໍ້ມູນຄູ່ຮ່ວມງານ iProX57 ພາຍໃຕ້ຊຸດຂໍ້ມູນ ID PXD034811 (ຊຸດຂໍ້ມູນ PDPL-MS).ຂໍ້ມູນດິບແມ່ນສະຫນອງໃຫ້ໃນຮູບແບບຂອງໄຟລ໌ຂໍ້ມູນດິບ.ບົດຄວາມນີ້ໃຫ້ຂໍ້ມູນຕົ້ນສະບັບ.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. ການຮູ້ຈັກບ້ານໃກ້ເຮືອນຄຽງ: ການນໍາໃຊ້ biotinylation ທີ່ຢູ່ໃກ້ຄຽງເພື່ອສະແດງລັກສະນະສະລັບສັບຊ້ອນຂອງທາດໂປຼຕີນແລະແຜນທີ່ organelles. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. ການຮູ້ຈັກບ້ານໃກ້ເຮືອນຄຽງ: ການນໍາໃຊ້ biotinylation ທີ່ຢູ່ໃກ້ຄຽງເພື່ອສະແດງລັກສະນະສະລັບສັບຊ້ອນຂອງທາດໂປຼຕີນແລະແຜນທີ່ organelles.Gingras, AS, Abe, KT ແລະ Raut, B. ຄວາມຄຸ້ນເຄີຍກັບສິ່ງອ້ອມຂ້າງ: ການນໍາໃຊ້ biotinylation ທີ່ຢູ່ໃກ້ຄຽງເພື່ອສະແດງລັກສະນະສະລັບສັບຊ້ອນຂອງທາດໂປຼຕີນແລະແຜນທີ່ organelles. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物嶾绘。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. ຄວາມເຂົ້າໃຈໃນບ້ານ: ໃຊ້ການເອື່ອຍອີງຂອງບ້ານໃກ້ເຮືອນຄຽງກັບຊີວິດຊີວະພາບ.Gingras, AS, Abe, KT ແລະ Raut, B. ຄວາມເຂົ້າໃຈຄວາມໃກ້ຊິດ: ລັກສະນະຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກສະລັບສັບຊ້ອນແລະການສ້າງແຜນທີ່ຂອງ organelles ໂດຍໃຊ້ biotinylation proximity-dependent.ປະຈຸບັນ.ຄວາມຄິດເຫັນຂອງຂ້ອຍ.ເຄມີ.ຊີວະວິທະຍາ 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.ການສ້າງແຜນທີ່ສະພາບແວດລ້ອມຈຸນລະພາກໂດຍການໂອນພະລັງງານ Dexter ໄປສູ່ຈຸລັງພູມຕ້ານທານ.ວິທະຍາສາດ 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.ເຄືອຂ່າຍຂະໜາດສອງ proteome ກວດພົບການປັບຕົວແບບສະເພາະເຊນຂອງການໂຕ້ຕອບຂອງມະນຸດ.ຕາລາງ 184, 3022–3040.e3028 (2021).